Avasimibe抑制ACAT，IC50为3.3 μM，也抑制人P450同工酶CYP2C9， CYP1A2和CYP2C19，IC50分别为2.9 μM， 13.9 μM和26.5 μM，

靶点

体外研究

Avasimibe 浓度为 1μg/ml 时，作用于人类单核细胞衍生的巨噬细胞 (HMMs)，通过在泡沫细胞形成期，抑制 LDL结合和降低清除剂受体数，而降低总胆固醇(TC) 和酯化胆固醇(EC)。Avasimibe 浓度为2μg/ml 时，与10μg/ml LDL预温育，增强胆固醇从 HMM 泡沫细胞中外排。Avasimibe抑制原代猴肝脏细胞培养基中的 脂蛋白(a)累积，抑制达 11.9% -31.3%，这种作用存在剂量依赖性，这种改变与 ApoA的降低有关。Avasimibe 在浓度为10 nM, 1 μM, 和 10 μM 时，在HepG2 细胞中温育24小时，分别使ApoB分泌到培养基中降低 25%, 27%, 和43%。Avasimibe 通过增强ApoB 的细胞内降解而不是降低 ApoB合成，来降低ApoB 分泌。 Avasimibe 作用于IC-21巨噬细胞，抑制 ACTC，IC50为3.3 μM。Avasimibe抑制人类 P450 同工酶CYP2C9, CYP1A2 和 CYP2C19，IC50分别为2.9 μM, 13.9 μM 和 26.5 μM。Avasimibe作用于胶质瘤细胞，抑制ACAT-1 表达和胆固醇酯的合成。Avasimibe 通过诱导细胞周期停滞和caspase-8 和 caspase-3 激活引起的凋亡，而抑制胶质瘤细胞生长。

体内研究

Avasimibe 作用于9只健康雄性猴子，显著降低脂蛋白(a)和总胆固醇水平，Avasimibe 每天按30 mg/kg 剂量口服饲喂，持续3周，脂蛋白(a)和总胆固醇水平分别降低到对照水平的68 和73%。Avasimibe 主要因为降低低密度脂蛋白(LDL)，而降低总胆固醇。

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

1.9931 mL

9.9657 mL

19.9314 mL

5 mM

0.3986 mL

1.9931 mL

3.9863 mL

10 mM

0.1993 mL

0.9966 mL

1.9931 mL

50 mM

0.0399 mL

0.1993 mL

0.3986 mL

P450 抑制研究:
使用至少15个捐赠者的人类肝脏微粒体(HLM)，进行所有抑制实验。 为了测定IC50 ，按体外 Km值，使用合适的底物探针。使用 100 mM 磷酸钾缓冲液(pH 7.4) 和 1 mM NADPH进行温育。CYP1A2 抑制研究中，在总体积为 0.5 ml中温育，使用 0.1 mg/ml HLM, 30 μM phenacetin, 1 mM NADPH, 在 Avasimibe (0, 0.3, 0.75, 1.5, 3, 7.5, 15, 30, 和 40 μM) 在磷酸钾缓冲液 pH 7.4 中，重复进行反应。在37oC下温育7分钟后，加入NADPH 开始酶反应。 25分钟后，使用500 μl 冰冻 100 ng/ml paracetamol-D4/CH3CN 将反应混合物猝灭。在室温下制备标准(4-醋氨酚)和质量对照(分低，中，高进行一式三份)。混合后, 0.2 ml 样本转移到另一个实验板中，在3000 rpm下离心10分钟后，进行LC/MS/MS 分析。

细胞实验

• Cell lines: 原代人类单核细胞衍生的巨噬细胞
• Concentrations: 1 μg/ml 或 2 μg/ml
• Incubation Time: 48 小时
• Method:

为了形成泡沫细胞，吸取生长培养基 (含10%人血清的RPMI 培养基)，使用RPMI培养基冲洗 BMMs 4次，然后在有或无agacLDL (100 μg 蛋白/ml) 和 Avasimibe (1 μg/ml)存在时，使用含 牛血清蛋白 (BSA,0.2%) 和DMSO( 0.2%)(空白培养基)的RPMI培养基 处理HMMs 48 小时。胆固醇外排实验中, HMMs 与 ag-acLDL (100 μg 蛋白/ml)预温育14小时 ,然后在有或无HDL(100 μg 蛋白/ml), Avasimibe(2 μg/ml) 或 HDL 和Avasimibe (2 μg/ml) 存在时，使用对照组RPMI 培养基处理24-48小时。此外, 通过HMMs与含ag-acLDL(100 μg 蛋白/ml)的RPMI培养基在乙醇喷雾(终浓度为 0.1%)中第一次温育24小时，ag-acLDL 使用[4-14C]FC (0.5 μCi/ml)进行放射性标记，测定 [14C]FC 的外观。移除培养基, 使用RPMI 培养基冲洗细胞3次，然后在有或无Avasimibe(1–10 μg/ml)存在时，使用对照组RPMI 培养基处理细胞 4–48 小时。在每个时间点，吸除培养基，离心，将未粘附的细胞制成颗粒。通过液体闪烁光谱测定[14C]FC外观。使用己烷：异丙醇 (3:2, v/v) 抽提细胞脂质1小时。使用石油醚：己烷：冰醋酸的溶剂系统（85:15:2，v/v），经过细胞抽提物和FC和EC标准样的等样进行薄层层析，测定细胞放射性标记的胆固醇分布。FC外排百分数按以下公式计算：培养基 [14C]FC dpm/ 细胞[14C] dpm×100。通过气液色谱法，使用豆甾醇(1 mg/ml) 作为内部标准，测量FC和TC质量。计算EC量作为TC和FC之间的区别。

动物实验

• Animal Models: 雄性食蟹猴
• Formulation: 无菌 0.9% NaCl溶液
• Dosages: 30 mg/kg
• Administration: 口服处理，每天一次，持续3周