AT7519 HCl是一种多重CDK抑制剂，作用于CDK1，2，4，6 和 9，无细胞试验中IC50为10-210 nM。它对CDK3作用较弱，而对CDK7几乎没有活性。

靶点

体外研究

AT7519是一种ATP竞争性CDK抑制剂，对CDK1的Ki值为38 nM。AT7519对所有非CDK激酶没有活性，除了GSK3β (IC50 = 89 nM)。AT7519在各种人肿瘤细胞系中表现出有效的抗增殖活性，IC50值范围为40 nM(对MCF-7)到940 nM(对SW620)，与对CDK1和CDK2的抑制一致。AT7519在多发性骨髓瘤(MM)细胞系中诱导剂量依赖性细胞毒性，在48小时，IC50值范围为0.5到2 μM，最敏感的细胞系为MM.1S (0.5 μM)和U266 (0.5 μM)，最耐药的是MM.1R (>2 μM)。它在外周血单核细胞(PBMNC)中不会诱导细胞毒性。AT7519部分抑制IL6和IGF-1诱导的增殖优势，以及骨髓基质细胞(BMSCs)的保护作用。AT7519在丝氨酸2和丝氨酸5位点诱导快速的RNA pol II CTD去磷酸化，并导致转录的抑制，部分有助于AT7519诱导的MM细胞的细胞毒性。AT7519通过下调GSK-3β磷酸化诱导GSK-3β的活化，这也有助于AT7519诱导的独立于转录抑制的细胞凋亡。

体内研究

在HCT116和HT29结肠癌异种移植物模型中，AT7519 (9.1 mg/kg)每天两次给药引起早期和晚期皮下注射的肿瘤退化。在人MM异种移植小鼠模型中，AT7519治疗(15 mg/kg)抑制肿瘤生长，并延长小鼠平均整体存活期，这与增加的caspase 3活化相关。

Dinaciclib (SCH727965)

MB4043

JNJ-7706621

MB4039

Roscovitine (Seliciclib,CYC202)

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.3883 mL

11.9414 mL

23.8829 mL

5 mM

0.4777 mL

2.3883 mL

4.7766 mL

10 mM

0.2388 mL

1.1941 mL

2.3883 mL

体外激酶试验:
CDK1，CDK2和GSK3-β的激酶反应都以放射性过滤器结合的形式进行。对CDK5的测定以DELFIA方式进行，CDKs 4和6 的测定以ELISA方式进行。对于CDKs 1和2，相关的CDK和0.12 μg/mL 组蛋白H1在20 mM MOPS，pH 7.2，25 mM β-甘油磷酸，5 mM EDTA，15 mM MgCl2，1 mM 原矾酸钠，1 mM DTT，0.1 mg/mL BSA，45 μM ATP (0.78 Ci/mmol)和不同浓度的AT7519中分别培育2小时和4小时。对于GSK3-β，相关的酶和5 μM糖原合成酶多肽2，以及10 mM MOPS pH 7.0，0.1 mg/mL BSA，0.001% Brij-35，0.5%甘油，0.2 mM EDTA，10 mM MgCl2，0.01% β-巯基乙醇，15 μM ATP (2.31 Ci/mmol)和不同浓度AT7519培育3小时。试验反应通过加入过量正磷酸停止，并使用Millipore MAPH滤板过滤。然后将板清洗，加入闪烁剂，放射性通过在Packard TopCount上闪烁计数测定。对于CDK5，CDK5/p35 和1μM 生物素化的组蛋白H1多肽(生物素-PKTPKKAKKL)在25 mM Tris-HCl，pH 7.5，2.5 mM MgCl2，0.025% Brij-35，0.1 mg/mL BSA，1 mM DTT，15 μM ATP和不同浓度的AT7519下培育30分钟。测定反应使用EDTA停止，转移到Neutravidin涂覆的板，磷酸化的多肽通过兔子磷酸-cdk1底物多克隆抗体和DELFIA铕标记的抗-兔子IgG第二抗体，使用时间分辨荧光(λex=335nm，λem=620nm)定量。对于CDK 4和6的测定，板用GST- pRb769-921涂覆，并用Superblock阻隔。CDK4或 6与15 mM MgCl2，50 mM HEPES，pH 7.4，1 mM DTT，1 mM EGTA，pH 8.0，0.02% Triton X-100，2.5% DMSO和不同浓度AT7519培育，加入ATP起始反应。30分钟后，通过加入0.5 M EDTA pH 8.0停止反应。然后清洗板，并与Superblock中稀释的第一抗体(抗-p-Rb丝氨酸780)培育1小时，随后与第二抗体(碱性磷酸酶相联的抗兔子抗体)再培育1小时。板使用Attophos系统发展，荧光性在Spectramax Gemini酶标仪上以450 nm的激发波长和580 nm的发射波长读取。在所有情况下，IC50值使用GraphPad Prism软件根据重复的曲线计算。

细胞实验

• Cell lines: MM.1S，MM.1R，RPMI8226，U266，RPMI8266，RPMI-Dox40，OPM1 细胞，原代 MM 细胞和 PBMNCs
• Concentrations: 以10 mM的浓度溶解于DMSO，终浓度为0.25-4 μM
• Incubation Time: 24 或 48 小时
• Method: 细胞与不同浓度的AT7519在37℃下培育24或48小时。细胞活性通过测量3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)染料吸光度评估。DNA合成通过氚化胸腺嘧啶摄取(3H-TdR)测量。细胞凋亡使用Annexin V/PI着色评估。发生细胞凋亡的细胞百分比以早期凋亡(膜联蛋白V阳性细胞)和晚期凋亡(膜联蛋白V阳性和PI-阳性细胞)的总和定义。

动物实验

• Animal Models: 皮下接种MM.1S细胞的雄性 SCID 小鼠
• Formulation: 溶解于0.9%盐水
• Dosages: 15 mg/kg/day
• Administration: i.p.给药