利巴韦林又名病毒唑、三氮唑核苷、尼斯可等,是广谱强效的抗病毒药物,因具有溶血性贫血、遗传毒性和生殖毒性等副作用,我国早在2005年就明令禁止利巴韦林等人用抗病毒药兽用。近年来利巴韦林也成为国家食品安全监督抽检的重要项目。
目前利巴韦林常用的检测方法为《SN/T 4519-2016 出口动物源食品中利巴韦林残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》,迪马科技参考相关标准,优化方法过程,采用新推出的PBA固相萃取柱产品,结合耐纯水的Spursil C18-EP极性改性液相色谱柱,推出鸡肉和鸡肝中利巴韦林检测方法。该方法具有回收率高、稳定性好、净化效果优异等特点,可供广大分析工作者参考。
1、适用范围
本方案适用于鸡肉、鸡肝等动物源性食品中利巴韦林的检测。
2、标准品配制
(1) 利巴韦林储备液1.0 mg/mL:准确称取适量标准品,用甲醇配制成利巴韦林1.0 mg/mL的储备液;
(2) 利巴韦林中间液:分别吸取适量单标储备液,用甲醇配制成1.0 μg/mL 和0.05 μg/mL的中间液;
(3) 利巴韦林-13C5内标储备液100.0 μg/mL:利巴韦林-13C5,甲醇配制,直接购买的储备液;
(4) 利巴韦林-13C5内标中间液:吸取适量内标储备液,用甲醇配制成0.1 μg/mL中间液。
3、提取
1. 称取5 g样品,加入利巴韦林-13C5内标中间液100 μL,12 mL三氯乙酸提取液(pH 4.8)*,和2.5 mL乙腈,振荡提取10 min,6000 rpm离心2 min,取上清液;
2. 下层残渣再用10 mL三氯乙酸提取液(pH 4.8),重复提取一次;
3. 合并两次提取液,并定容至25 mL,取出5 mL。
*三氯乙酸提取液(pH 4.8):称20 g三氯乙酸,加入950 mL水溶解,用氨水调节pH至4.8,用水定容至1000 mL。
4、酶解
1. 5 mL提取液加入1 mL 2 mol/L乙酸铵(pH 4.8)*,加入100 μL酶*,涡旋混合1 min,放入37 ℃烘箱加热反应2 h。
2. 酶解完成后,拿出冷却到室温,加入氨水,调节pH至8.5,混匀,6000 rpm离心2 min,取出上清液待净化。
*2 mol/L乙酸铵(pH 4.8):称取7.7 g乙酸铵,加入45 mL水溶解,然后用乙酸调节pH至4.8;
*酶溶液的配制:固体酶制剂:酶活度:10.4 u/mg磷酸酯酶,取适量酶制剂,用水稀释至酶活0.04 u/mL。
5、净化——ProElut PBA 100 mg/3 mL (Cat.# 68403)
(1)活 化: |
依次用3 mL乙腈、3 mL乙腈-1%甲酸水*、3 mL乙酸铵缓冲溶液(pH 8.5)*活化; |
(2)上 样: |
加入待净化液,弃去流出液; |
(3)淋 洗: |
依次用5 mL 10%乙腈-乙酸铵缓冲溶液(pH 8.5)*、2 mL 5%氨水甲醇淋洗,弃去流出液,小柱真空负压抽干0.5 min; |
(4)洗 脱: |
加入2 mL 0.5%甲酸水,抽干小柱,接收全部流出液混匀,过Nylon膜(Cat#:37177)上机分析。 |
*乙腈-1%甲酸水:乙腈:1%甲酸水(体积比3:1);
*乙酸铵缓冲溶液(pH8.5):称取3.85 g乙酸铵,加入180 mL水溶解,然后用氨水调节pH至8.5;
*10%乙腈-乙酸铵缓冲溶液(pH 8.5):乙腈:pH 8.5乙酸铵缓冲溶液(体积比1:9)。
6、分析条件
UPLC 条件
色谱柱:Spursil C18-EP, 150 x 2.1 mm, 3 μm (Cat#:82113)
流 速:0.4 mL/min 进样量:10 μL 柱 温:35 ℃
流动相:A: 0.2%甲酸水 B: 乙腈
梯度
时间(min) |
0 |
2 |
4.5 |
6 |
7 |
7.5 |
15 |
A(%) |
100 |
100 |
80 |
40 |
40 |
100 |
100 |
B(%) |
0 |
0 |
20 |
60 |
60 |
0 |
0 |
质谱条件
电离模式:ESI 扫描方式:正离子扫描
检测方式:多反应监测 电喷雾电压:5500 V
雾化气压力:50 psi 辅助气压力:50 psi
气帘气压力:20 psi 离子源温度:500 ℃
定性离子对、定量离子对、碰撞气能量及去簇电压见下表
药物名称 |
定性离子对 (m/z) (母离子/子离子) |
定量离子对 (m/z) (母离子/子离子) |
碰撞气能量/eV |
去簇电压/V |
利巴韦林 |
245.2/113.1 |
245.2/113.1 |
11 |
64 |
245.2/96.2 |
15 |
|||
利巴韦林-13C5 |
250.3/113.3 |
11 |
62 |
7、添加回收结果
动物源性食品中利巴韦林检测的添加回收结果(%)
基质 |
添加水平1.0 μg/kg |
添加水平20.0 μg/kg |
加标量:利巴韦林中间液0.05 μg/mL, 加100 μL |
加标量:利巴韦林中间液1.0 μg/mL, 加100 μL |
|
鸡肉 |
107.1 |
98.6 |
鸡肝 |
108.2 |
105.3 |
相关产品信息
货号 |
名称 |
规格 |
样品前处理 |
||
68403 |
苯硼酸固相萃取柱ProElut PBA |
100 mg/3 mL 50/pkg |
244358 |
12管防交叉污染真空SPE萃取装置 |
12位 |
4803 |
1,3,6 mL柱管通用连接器 |
15/pk |
4806 |
考克(控制流量) |
15/pk |
99011 |
真空/正压两用泵,无油 |
1/pk |
99013 |
抽滤瓶套装 (包括硅橡胶管2米,2 L抽滤瓶及橡胶塞) |
1/pk |
37177 |
ProMax针头式过滤器 Nylon |
13 mm,0.22 μm 100/pk |
色谱柱 |
||
82113 |
极性改性反相色谱柱 Spursil C18-EP |
150 x 2.1 mm, 3 µm |
HPLC溶剂 |
||
50101 |
乙腈 HPLC级 |
4 L |
50163 |
乙腈 LC-MS级 |
4 L |
50102 |
甲醇 HPLC级 |
4 L |
50164 |
甲醇 LC-MS级 |
4 L |
50144 |
甲酸 HPLC级 |
50 mL |
50153 |
甲酸 LC-MS级 |
50 mL |
50132 |
乙酸 HPLC级 |
50 mL |
50138 |
乙酸铵HPLC级 |
100 g |
通用色谱产品 |
||
52401A |
瓶架/白色 |
50孔 |
52401B |
瓶架/蓝色 |
50孔 |
1034 |
样品瓶 (棕色/螺纹) |
2 mL, 100/pk |
1035 |
样品瓶盖/含垫 (已经组装) |
100/pk |
H80465 |
HPLC 进样针, 平头 |
25 μL |
红色产品货号#1034、#1035火热促销中……