ZSTK474抑制I型PI3K亚型，在无细胞试验中IC50为37 nM，对PI3Kδ作用最显著。

特性

首个用于体内的口服给药的PI3K抑制剂。

靶点

体外研究

ZSTK474在1 μM浓度下有效将PI3K活性降低为对照组水平的4.7%，而LY2194002仅将其活性降低为对照组的44.6%。ZSTK474抑制重组p110β，-γ，和 -δ活性，IC50 分别为17 nM，53 nM，和6 nM。ZSTK474对一组39个人类癌细胞系表现出有效的抗增殖活性，平均GI50为0.32 μM，比平均GI50 分别为7.4 μM和10 μM的LY294002与wortmannin更有效。1 μM ZSTK474治疗阻断小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中血小板源生长因子诱导的胞膜边缘波动和PIP3产生。10 μM ZSTK474诱导OVCAR3细胞凋亡，并诱导细胞周期完全的G1期阻滞，但是不引起A549细胞凋亡。0.5 μM ZSTK474治疗显著减少磷酸化的Akt 和GSK-3β水平，以及细胞周期蛋白D1蛋白质的表达。ZSTK474也会剂量依赖性抑制其他参与细胞增殖调节的下游信号组分，包括FKHRL1，FKHR，TSC-2，mTOR，和p70S6K的磷酸化。ZSTK474在0.1 μM下不抑制mTOR，甚至在100 μM浓度下，ZSTK474仅抑制少于40%的mTOR活性。ZSTK474阻断人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中VEGF诱导的细胞迁移和管腔形成，并且抑制RXF-631L细胞中HIF-1α表达与VEGF分泌，表现出有效的体外抗血管生成活性。 ZSTK474治疗抑制伴刀豆球蛋白A激活的T细胞中IFNγ 和IL-17的产生，并通过成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)抑制增殖和PGE(2)产生。

体内研究

ZSTK474口服给药，剂量依赖性抑制皮下植入的小鼠B16F10黑色素瘤的生长，在第14天，100，200，或400 mg/kg的剂量分别产生28.5%，7.1%，或4.9%的肿瘤消退，效果优于其他四种主要的抗癌药irinotecan，cisplatin，doxorubicin，和5-fluorouracil，其使肿瘤消退的各自最大耐受剂量分别为96%，35.7%，24%，或 68.3%。400 mg/kg ZSTK474治疗完全抑制小鼠体内A549，PC-3，和WiDr的生长，并诱导A549移植瘤的消退。ZSTK474显著抑制RXF-631L异种移植模型中的肿瘤生长，与 ZSTK474处理的小鼠体内微脉管数量显著减少相一致。在大鼠体内，ZSTK474口服给药改善佐剂性关节炎的发展。

GDC-0980 (RG7422)

MB3871

XL147 analogue

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.3957 mL

11.9786 mL

23.9573 mL

5 mM

0.4791 mL

2.3957 mL

4.7915 mL

10 mM

0.2396 mL

1.1979 mL

2.3957 mL

50 mM

0.0479 mL

0.2396 mL

0.4791 mL

PI3K活性抑制:
A549细胞在包含20 mM Tris-HCl (pH 7.5)，150 mM NaCl，5 mM EDTA，和1% Igepal CA-630的缓冲液中裂解，裂解物在4℃下以20,000 g裂解10分钟，上层清液用作细胞裂解物(蛋白质= 2-4 mg/mL)。为免疫沉淀PI3K，200 μL细胞裂解物与抗p85多克隆抗体和蛋白G琼脂糖(5 μL)共培养。PI3Kα，PI3Kβ，和PI3Kδ能够被抗p85多克隆抗体免疫沉淀。包含免疫沉淀物的琼脂糖小球用缓冲液A(pH 7.5的20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，5 mM EDTA，和1% Igepal CA-630)清洗两次，用缓冲液B (500 mM LiCl 和100 mM Tris-HCl，pH 7.5)清洗一次，蒸馏水清洗一次，缓冲液C(100 mM NaCl和20 mM Tris-HCl，pH 7.5)清洗一次。免疫沉淀物悬浮在20 μL包含200 μg/mL磷脂酰肌醇的缓冲液C中。混合物与逐渐增加浓度的ZSTK474在25 °C下预培养5分钟。加入[γ-32P]ATP (2 μCi每个试验混合物；终浓度，20 μM) 和MgCl2 (终浓度，20 mM)起始反应。反应混合物在25 °C下培养20分钟。磷脂酰肌醇的磷酸化产物通过薄层色谱法分离，并通过放射自显影法可视化。将磷脂酰肌醇-3-磷酸盐区域从板上刮下，放射性使用液体闪烁光谱法测量。ZSTK474的抑制水平以每分钟计数所得的不包含ZSTK474的32P百分比确定。

细胞实验

• Cell lines: MCF-7，HT-29，HCT-116，OVCAR3，A549，等
• Concentrations: 在DMSO中溶解，终浓度为~10 μM
• Incubation Time: 48小时
• Method: 细胞在逐渐增加浓度的ZSTK474下暴露48小时。细胞增殖的抑制使用磺酰罗丹明B测定法通过测量总细胞蛋白的改变进行评估。细胞凋亡使用流式细胞术通过染色质凝聚测定。对于染色质凝聚试验，细胞用Hoechst 33342着色，并通过荧光显微法检查。ZSTK474诱导的形态学改变，比如染色质的凝聚，表明了细胞凋亡。对于流式细胞术分析，采集细胞，用冰浴PBS清洗，并固定在70%乙醇中。然后细胞再次用冰浴PBS清洗，用RNase A (500 μg/mL)在37 °C下处理1小时，并用碘化丙啶(25 μg/mL)着色。细胞的DNA含量使用流式细胞仪分析。

动物实验

• Animal Models: 皮下注射B16F10细胞的雄性 BDF1小鼠，皮下接种A549，PC-3，或 WiDr 细胞的雌性 BALB/c 裸鼠
• Formulation: 悬浮在含5%羟丙甲纤维素的水中，成固态分散体
• Dosages: ~400 mg/kg/day
• Administration: 口服