U0126-EtOH是一种高度选择性的MEK1/2抑制剂，无细胞试验中IC50为0.07 μM/0.06 μM，作用于ΔN3-S218E/S222D MEK的亲和力比PD098059强100倍。

特性

A chemically synthesized and highly selective inhibitor of both MEK1 and MEK2.

靶点

体外研究

与MEK抑制剂PD098059（IC50为10 μM）相比，U0126高亲和力（高100多倍）作用于重组组成型激活的突变MEK1 (DN3-S218E/S222D)，IC50为72 nM。与PD98059类似, U0126 非竞争性抑制MEK，说明 U0126结合在MEK的特定位点上。与作用于多种其他激酶，如PKC, Abl, Raf, MEKK, ERK, JNK, MKK-3, MKK-4/SEK, MKK-6, Cdk2, 和Cdk4相比，U0126 更显著高选择性作用于MEK1和MKE2。U0126 作用于TPA刺激的细胞，通过阻断 MAPK信号传递，显著抑制c-Fos和c-Jun mRNA的上调及蛋白水平，抑制达50-80%，导致AP-1转录活性受抑制，IC50为0.96 μM。10 μM U0126通过抑制 ERK2而不是ERK1磷酸化，显著抑制细胞死亡。根据对ERK 和mTOR-p70S6K通路的同时抑制，U0126选择性抑制贴壁非依赖性Ki-ras-转化的大鼠成纤维细胞生长，也抑制组成型激活ERK, MDA-MB231和HBC4的肿瘤细胞系生长。

体内研究

U0126 作用于携带脑贫血-再灌注的CA1 锥体细胞的沙鼠，降低ERK1/2磷酸化，和随后的神经元死亡，这种作用存在剂量依赖性。U0126 按200 μg/kg剂量作用于局灶性脑缺血小鼠，显著降低 42%梗塞体积，也降低 41% 脑萎缩。U0126按~30 mg/kg剂量腹腔注射给药患过敏性哮喘的小鼠，具有显著的抗炎效果，这种作用存在剂量依赖性，通过抑制 IL-4, IL-5, IL-13, eotaxin, VCAM-1, 全部IgE和OVA特定的IgE和IgG1。

AZD8330

MB4069

Binimetinib, ARRY-438162

MB4064

Pimasertib (AS-703026)

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.3443 mL

11.7217 mL

23.4434 mL

5 mM

0.4689 mL

2.3443 mL

4.6887 mL

10 mM

0.2344 mL

1.1722 mL

2.3443 mL

50 mM

0.0469 mL

0.2344 mL

0.4689 mL

体外激酶实验:
使用重组组成型激活的突变MEK-1 (DN3-S218E/S222D) 或组成型激活的 MEK-2(S222E/S226D)进行实验。使用 96孔 硝化纤维素过滤装置测量反应速度。在酶浓度为 10 nM时，在20 mM Hepes, 10 mM MgCl2, 5 mM β-巯基乙醇, 0.1 mg/mL BSA, pH 7.4, 中室温下进行反应。加入[γ-33P]ATP到预混合的U0126反应混合物中开始反应，每6分钟采集100 μL等分样，然后转移到含50 mM EDTA 的96孔硝化纤维模板上，阻止反应进行。提取模板，使用buffer 在真空下冲洗4次。使用30 μL Microscint-20 闪烁液填满每孔，使用Top Count 闪烁计数器测定33P-磷酸化的ERK的放射性。从放射性对时间曲线获得反应速度。ERK和 ATP浓度分别为400 nM和40 μM。数据绘制成抑制百分数，通过非线性最小二乘回归，根据 Langmuir 等温方程测定IC50值。

细胞实验

• Cell lines: MCF-7, MDAMB453, SKBR3, ZR75-1, BSY1, HBC4, HBC5, 和 MDA-MB231
• Concentrations: 溶于DMSO,终浓度为~50 μM
• Incubation Time: 24, 48, 或96小时
• Method: 为了测量贴壁非依赖性生长，细胞按每孔 5000 个细胞接种在聚HEMA包被的96孔板上，体积为135 μL。加入培养基稀释的15 μL 不同浓度U0126，然后细胞培养96小时。加入15 μL MTT 溶液(5 mg/mL，溶于 PBS)，再温育4小时。加入 100 μL SDS溶液 (20% ，溶于10 mM HCl), MTT甲臜被溶解，24小时后，在570 nm 处测量吸光值，然后使用酶标仪在 690 nm处测定参考波长。为了测定DNA 片段,细胞接种在聚HEMA包被或未包被的组织培养塑料 35-mm盘上，然后温育24小时。使用U0126处理细胞24-48小时，使用PBS冲洗，然后使用10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM EDTA,和0.5% Triton X-100溶解。在10,000 g转速下离心10分钟，分离低分子量DNA片段。使用20 μg/mL RNase A处理含等量蛋白的上清液1小时，然后使用 20 μg/mL蛋白酶 K在37oC下处理30分钟。使用2-丙醇沉淀DNA，在2%琼脂糖凝胶上跑胶，然后通过SYBR Green I 染色观察。

动物实验

• Animal Models: 携带双侧颈总动脉闭塞(BCAO)诱导脑部缺血的雄性沙土鼠,携带大脑中动脉闭塞(MCAO) 诱导局灶性脑缺血的雄性ICR或ddY小鼠
• Formulation: 溶于DMSO,然后在0.1 M PBS中稀释
• Dosages: ~400 μg/kg
• Administration: 静脉注射