生物活性
产品描述 |
Flavopiridol (Alvocidib)与ATP竞争性抑制CDKs,包括CDK1, CDK2, CDK4和CDK6,IC50约为40 nM。作用于CDK1, 2, 4, 6比作用于CDK7选择性强7.5倍。Flavopiridol最初被发现能抑制EGFR和PKA。Phase 1/2。 |
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靶点 |
CDK1 [1] |
CDK2 [1] |
CDK4 [1] |
CDK6 [1] |
CDK7 [1] |
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IC50 |
40 nM |
40 nM |
40 nM |
40 nM |
300 nM |
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体外研究 |
作为CDK广谱抑制剂,Flavopiridol可以抑制细胞周期进展,使其停在G1期或G2期。0.3 μM Flavopiridol作用于MCF-7或MDA-MB-468细胞,通过抑制CDK4或CDK2激酶活性,而诱导细胞周期停在G1 期。[4] Flavopiridol 作用于无关激酶,如MAP, PAK, PKC, 和 EGFR,活性低很多,IC50 >14 μM。Flavopiridol 显著抑制HCT116, A2780, PC3, 和 Mia PaCa-2 细胞集落生长,IC50分别为 13 nM, 15 nM, 10 nM, 和 36 nM。[1] Flavopiridol作用于多种肿瘤细胞系,具有细胞毒性,IC50为作用于LNCAP 的 16 nM 到作用于 K562的130 nM。[5]Flavopiridol也有效抑制糖原合成激酶-3(GSK-3) 的活性,IC50为 280 nm。[2]与其他CDKs相比, Flavopiridol抑制CDK7活性时效果稍弱,IC50为875 nM。 Flavopiridol (0.5 μM) 抑制pSer807/811 Rb 和pThr199 NPM,而在pThr821 Rb上观察到轻微变化。Flavopiridol也降低全部RNA聚合酶 II 水平, 及 RNA聚合酶 II在CTD重复序列在 Ser2 Ser5位点磷酸化。[3] |
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体内研究 |
Flavopiridol按7.5 mg/kg剂量处理P388 小鼠白血病,持续7天,具有轻微抗癌活性,导致%T/C值为110,且有效作用于皮下抑制人A2780卵巢癌的裸鼠,细胞对数杀灭(LCK)为1.5 。[5] Flavopiridol按 1-2.5 mg/kg 剂量处理小鼠,持续10天,通过抑制滑膜增生和关节损伤,而显著抑制胶原性关节炎,这种作用存在剂量依赖性,然而抗II型胶原(CII) 抗体的血清浓度,和II型胶原对应的增殖维持不变。[6] |
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特征 |
Flavopiridol是第一个应用于人临床实验的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。 |
推荐的实验操作(此推荐来自于公开的文献所以并不保证其有效性)
激酶实验: [1] [2] [3]
CDK 激酶实验 |
CDK1/cyclin B1 激酶实验中, 激酶反应包含100 ng表达 GST-CDK1/cyclin B1(人)复合体的 杆状病毒, 1 μg 组蛋白 HI, 0.2 μCi [γ-33P]ATP, 25 μM ATP溶于 50 μL 激酶buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.5 mM DTT)。CDK2/cyclin E 激酶实验中, 激酶反应包含5 ng表达GST-CDK2/cyclin E (人)复合体的杆状病毒, 0.5 μg GST-RB 融合蛋白(成视网膜细胞瘤蛋白776-928 氨基酸), 0.2 μCi [γ-33P]ATP, 25 μM ATP溶于50 μL 激酶buffer (50 mM Hepes, pH 8.0, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 2 mM DTT)。CDK4/cyclin D1激酶实验中, 激酶反应含150 ng 表达GST-CDK4/cyclin D1 (人)的杆状病毒, 280 ng Stag-cyclin D1, 0.5 μg GST-RB 融合蛋白(成视网膜细胞瘤蛋白776-928 氨基酸), 0.2 μCi [γ-33P]ATP, 25 μM ATP 溶于50 μL激酶 buffer (50 mM Hepes, pH 8.0, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 2 mM DTT)。30oC下, CDK1 和CDK2反应温育45分钟,CDK4反应温育1小时,加入终浓度为15%的冰冻三氯乙酸(TCA) 终止反应。 使用Filtermate通用收集器,收集TCA沉淀物转移到GF/C 非过滤板上, 使用TopCount 96孔液体闪烁计数器测量过滤数。Flavopiridol溶于 10 mM二甲基甲酰胺(DMF) 中,测定六种浓度,每种重复测三次。实验中DMF终浓度为 2%。通过回归曲线分析获得IC50值,变异系数为 16%。测定Flavopiridol作用于 CDK6的活性, 进行过滤-结合实验。 反应混合物按如下结合: 2 μL CDK6 (0.7 mg/μL), 5 μL 组蛋白 H1 (6 mg/mL), 14 μL 激酶 buffer (60 mM β-甘油磷酸, 30 mM p-磷酸硝基苯酯, 25 mM MOPS (pH 7.0), 5 mM EGTA, 15 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1 mM 钒酸钠), 在50% DMSO中稀释的 3 μL 浓度不断增长的Flavopiridol ,及6 μL 33P-ATP (1 mCi/mL),非放射性 ATP,浓度为90 μM,(终浓度为15 μM)。加入33P-ATP开始反应。 反应在30oC下温育20分钟。25 μL等分的上清液点样到Whatman P81 磷酸纤维素膜上。使用1% 磷酸溶液冲洗过滤器5次。 在1 mL闪烁液存在时测定湿过滤器。使用 50 nM 重组Cdk9/cyclin T在 50 mM HEPES pH 7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 3 μM Na3VO4, 150 μM RNA 聚合酶CDT 肽和80 μM ATP中测定Cdk9活性。在相同buffer中使用37 nM纯化激酶,在200 μM ATP 存在时,10 μM 髓鞘蛋白(MBP)作为底物,进行Cdk7检测实验。使用强阴离子交换剂-为基础的检测实验或闪烁接近实验测定Flavopiridol 作用于CDK9和CDK7的效果。通过剂量反应曲线计算IC50值。 |
细胞试验: [5]
细胞系 |
MCF-7, LNCAP, PC3, HCT116, CACO-2, A549, HL60, K562, 等等 |
浓度 |
溶于DMSO,终浓度为 ~10 μM |
处理时间 |
72小时 |
方法 |
使用不同浓度 Flavopiridol 处理细胞72小时,加入四唑染料,MTS和吩嗪硫酸甲酯。3 小时后,在492 nm处测定吸光值,与存活细胞数成比例。结果表示为IC50值。为了分析细胞周期,细胞在仲甲醛和乙醇中混合,冲洗,然后再悬浮在TdT 酶和 FITC-dUTP染色液中,再冲洗,使用PI染色,随后进行RNA酶处理,最后使用流式细胞仪分析。 |
动物实验: [5]
动物模型 |
腹腔注射P388 腹水白血病细胞的雌性Balb/c×DBA/2J F1小鼠,皮下移植A2780, Br-cycE, 或A431细胞的Balb/c nu/nu裸鼠 |
配制 |
溶于Cremophor/乙醇 (50:50) ,然后在水中稀释 |
剂量 |
~7.5 mg/kg/day |
给药处理 |
腹腔注射 |
不同实验动物依据体表面积的等效剂量转换表(数据来源于FDA指南)
小鼠 | 大鼠 | 兔 | 豚鼠 | 仓鼠 | 狗 | |
重量 (kg) | 0.02 | 0.15 | 1.8 | 0.4 | 0.08 | 10 |
体表面积 (m2) | 0.007 | 0.025 | 0.15 | 0.05 | 0.02 | 0.5 |
Km 系数 | 3 | 6 | 12 | 8 | 5 | 20 |
动物A (mg/kg) = 动物B (mg/kg) × | 动物B的Km系数 |
动物A的Km系数 |
例如,依据体表面积折算法,将白藜芦醇用于小鼠的剂量22.4 mg/kg 换算成大鼠的剂量,需要将22.4 mg/kg 乘以小鼠的Km系数(3),再除以大鼠的Km系数(6),得到白藜芦醇用于大鼠的等效剂量为11.2 mg/kg。
大鼠剂量 (mg/kg) = 小鼠剂量 (22.4 mg/kg) × | 小鼠的Km系数(3) | = 11.2 mg/kg |
大鼠的Km系数(6) |
参考文献
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