Tiplaxtinin(PAI-039)是口服有效的选择性纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)抑制剂，IC50为2.7 μM。

靶点

体外研究

在一组人膀胱癌细胞系中，PAI-1减少细胞增殖，细胞粘附，和集落形成，并诱导细胞凋亡和失巢凋亡。

体内研究

在大鼠颈动脉血栓形成模型中，Tiplaxtinin (1 mg/kg, p.o.)增加闭塞时间，并防止颈动脉血流量减少。在C57BL/6J小鼠中，Tiplaxtinin(1 mg/g 食物)减弱Ang II-诱导的主动脉重构。在未处理的1型糖尿病小鼠中，Tiplaxtinin (p.o.)恢复骨骼肌再生。在负荷人癌症细胞系T24和HeLa异种移植物的无胸腺小鼠中，Tiplaxtinin (1 mg/kg, p.o.)降低肿瘤异种移植物的生长，与肿瘤血管生成的减少，细胞增殖的减少，和细胞凋亡的增加相关。

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.2759 mL

11.3797 mL

22.7593 mL

5 mM

0.4552 mL

2.2759 mL

4.5519 mL

10 mM

0.2276 mL

1.1380 mL

2.2759 mL

50 mM

0.0455 mL

0.2276 mL

0.4552 mL

直接作用于 PAI-I的体外活性试验:
显色试验通过将tiplaxtinin (10–100 µM终浓度，最大DMSO浓度为0.2%)加入重组人PAI-1 (140 nM 溶于pH 6.6缓冲液)起始。在25°C下培育15分钟后，加入70 nM重组人t-PA，结合tiplaxtinin，PAI-1和tPA再培育30分钟。二次培育后，加入Spectrozyme tPA，吸光度在405 nm下在0分钟和60分钟时读取。在tiplaxtinin/PAI-1治疗下，相对PAI-1抑制活性相当于残基tPA活性。对照处理组包括PAI-1对tPA的完全抑制(摩尔比率为2:1)，以及没有其他任何影响下tiplaxtinin单独对tPA的作用。免疫功能试验基于tPA 和活性PAI-1之间非-SDS解离的相互作用。将测定板用100 µl t-PA溶液(10 µg/ml的TBS溶液)涂覆，并保持在4 °C下过夜。Tiplaxtinin溶于DMSO，并如上所述稀释到1-100 µM的终浓度。然后Tiplaxtinin与人PAI-1 (50 ng/ml)培育15分钟，将等份该溶液加入t-PA-涂覆的板，进行1小时。将溶液从板中抽吸，然后将其用由0.05% Tween 20 和0.1% BSA的TBS组成的缓冲液洗涤。该试验仅检测结合到板的活性抑制PAI-1 (不是潜在的或底物)，并且使用针对人PAI-1 (MA33B8)的单克隆抗体定量。1000X稀释的MA33B8加入板中，培育1小时，抽吸并洗涤。加入由山羊抗-小鼠IgG (H+L)-AP碱性磷酸酶结合物组成的第二抗体，培育1小时，抽吸并洗涤。加入100 µl等份碱性磷酸酶，60分钟后在405 nm下测定吸光度。不同浓度tiplaxtinin下，结合到t-PA的剩余活性PAI-1的定量用于测定IC50，通过将结果拟合到logistic剂量-响应程序确定，IC50定义为抑制50% PAI-1活性所需的化合物浓度。根据0-100 ng/ml范围内人PAI-1的标准曲线，试验的灵敏度为5 ng/ml人PAI-1。

细胞实验：

• Cell lines: T24，UM-UC-14，UROtsa，和 HeLa 细胞
• Concentrations: ~50 μM
• Incubation Time: 24 h
• Method: 简而言之，细胞系，T24，UM-UC-14，UROtsa，和HeLa细胞以一式三份1 ×103细胞/孔的密度接种到96孔板，并使其附着24小时。随后将tiplaxtinin加入孔中，在指示浓度下培育。细胞增殖通过CellTiter-Glo发光细胞活性法根据制造商说明在24小时测定，tiplaxtinin的IC50在Graphpad Prism中测定。发光情况使用FLUOstar OPTIMA阅读器测量。

动物实验：

• Animal Models: 颈动脉血栓形成的大鼠
• Formulation: 2.0% Tween 80/0.5% 甲基纤维素
• Dosages: 1 mg/kg
• Administration: p.o.