Pemetrexed Disodium Hydrate 是一种新型抗叶酸剂和抗代谢物质，作用于TS，DHFR 和 GARFT，Ki分别为1.3 nM，7.2 nM 和 65 nM。

靶点

体外研究

Pemetrexed disodium在CCRF-CEM 白血病，GC3/C1结肠癌，和HCT-8回盲部结肠癌细胞中表现出抗肿瘤活性，IC50 分别为25 nM，34 nM 和 220 nM。一项最近的研究表明cisplatin和Pemetrexed结合SOCS-1基因转移，通过抑制细胞增殖和侵袭，以及诱导感染腺病毒表达SOCS-1载体的MPM细胞凋亡，表现出抗肿瘤作用。

体内研究

在人H460非小细胞肺癌异种移植物中，Pemetrexed disodium产生持续依赖性肿瘤生长延迟(TGD)。

MB2040

培美曲塞酸

MB2040-S

培美曲塞酸(标准品)

酶测定和方法:

• TS活性使用分光光度法测定，监测由于产物7,8-dihydrofolate的形成，导致的340 nm处吸光度增加。实验缓冲液包含50 mM N-tris[羟甲基]甲基-2-氨基乙磺酸，25 mM MgC12，6.5 mM甲醛，1 mM EDTA，和75 mM 2-巯基乙醇，pH 7.4。脱氧鸟苷酸单磷酸盐，6R-MTHF，和hIS的浓度分别为100 μM，30μM 和 30 nM (1.7 milliunits/mL)。在6R-MTHF浓度下，测定未抑制的反应和6个浓度的抑制剂。Ki app值使用ENZFITTER程序通过非线性回归分析将数据拟合到Morrison方程测定。Ki值使用如下方程式计算：Ki app= Ki(1 + [S]/Km)，其中[S] 等于30 μM，Km 等于 3 μM。DHFR活性通过分光光度法在340 nm下监测底物NADPH和7,8-二氢叶酸的消失测定。反应于25°C下在0.5 mL 50 mM磷酸钾缓冲液中进行，缓冲液包含150 mM KC1 和 10 nM 2-巯基乙醇，pH 7.5，和14 nM (0.34 milliunitlmL) DHFR。NADPH浓度为10 μM，而7,8-二氢叶酸的浓度在5，10，或15 μM间变化。在每个7,8-二氢叶酸的浓度下，未抑制的反应和7个抑制剂浓度被测定。使用ENZFITI’ER微机程序通过非线性回归分析将数据拟合到Morrison方程以得到Ki app值。Ki app= Ki(1 + [S]/Km)，其中[S] 等于使用的7,8-二氢叶酸的浓度，而7,8-二氢叶酸的Km等于0.15 μM。GARFT活性通过分光光度法在295 nm下监测产物5,8-dideazafolate形成导致吸光度的增加进行测定。反应溶剂包含75 mM HEPES，20% 甘油，和50 mM a-thioglygerol，pH 7.5，温度为25°C。底物和酶的浓度为10 μM α,β-甘氨酰胺核苷酸，0-10 μM 10-formyl-5,8-dideazafolic acid，和10 nM (1.9 milliunits/mL) GARFT。Ki值使用Beckman DU640分光光度计的酶作用机理程序计算，其使用非线性回归分析将数据拟合到竞争性抑制的Michaelis-Menten方程。

细胞实验

• Cell lines: CCRF-CEM 白血病，GC3/C1 结肠癌，和 HCT-8 回盲肠肿瘤细胞
• Concentrations: 0-30 μM
• Incubation Time: 72小时
• Method: 生成剂量反应曲线以确定50%生长抑制(IC50)的浓度。Pemetrexed disodium首先以4 mg/mL的浓度溶解于DMSO，进一步用细胞培养基稀释到所需浓度。完全培养基中的CRF-CEM白血病细胞加入到总体积为2.0 mL的24-孔 Cluster板。将不同浓度的Pemetrexed disodium加入到孔中，并重复两份，使DMSO的终浓度为0.5%。板在37 °C，5% CO2的空气中培养72小时。培养结束时，细胞数量在ZBI Coulter计数器上测定。对于几个研究，每个化合物的IC50s在300 μM AICA，5 μM 胸腺嘧啶，100 μM 次黄嘌呤，或5 μM胸腺嘧啶结合100 μM 次黄嘌呤存在下测定。对于粘附的肿瘤细胞，修正的原始MTT比色测定用于测量细胞毒性。人肿瘤细胞接种在100 μL试验培养基/孔的96孔平底组织培养板。试验培养基包含不含叶酸的RPMI 1640，用10% FCS和作为唯一叶酸来源的2 nM 亚叶酸或2.3 μM 叶酸进行补充。孔1A作为空白对照。叶酸拮抗物的储备溶液在Dulbecco’s PBS中以1 mg/mL制备，随后一系列2倍稀释物在PBS中制备。每个浓度的10μL等分试样加入到孔中，并重复三份。板在37 °C，潮湿的5% CO2空气中培养72小时。MTT以5 mg/mL溶解在PBS中，10 μL储备MTF溶液加入到每个测试孔中，将板在37 °C下再培养2个小时。接下来的培养，将100 μL DMSO加入到每孔中。甲瓒完全溶解后，板在Dynatech MR600阅读器上读取数据，测试波长为570 nm，参考波长为630 nm。与对照组相比，抑制50%细胞生长所需的药物浓度为IC50。

动物实验

• Animal Models: EMT-6 乳腺癌，人 HCT 116 结肠癌，和人 H460 非小细胞肺癌皮下注射到裸鼠体内。
• Formulation: Pemetrexed disodium 溶于DMSO，然后在水中稀释。
• Dosages: 100 mg/kg 或 150 mg/kg
• Administration: i.p.给药