ZM 336372是一种有效的，选择性的c-Raf抑制剂，IC50为70 nM，比作用于B-RAF选择性高10倍，对PKA/B/C， AMPK， p70S6等没有抑制作用。

靶点

C-Raf  70 nM

体外研究

ZM 336372作用于C-Raf 的选择性是作用于B-Raf的10倍。ZM 336372微弱抑制SAPK2a/p38α和SAPK2b/p38β，IC50 为2 μM，即使在高达50 μM浓度下，对C-Raf的选择性也高于包括PKA，PKC，AMPK，p42 MAPK，MKK1，SAPK1/JNK，和CDK1等17种其他蛋白激酶。ZM 336372不会阻止生长因子或佛波酯诱导的MKKl或p42 MAPK/ERK2激活。此外，ZM 336372不会逆转Ras- 或Raf-转化细胞系的表现型。ZM 336372治疗诱导>100的c-Raf 和B-Raf亚型激活，但是它不会引起MKKI或p42 MAPK/ERKP激活，也不会诱导负载GTP的Ras增加，表明反馈控制环路通过Raf亚型抑制它们自身激活而存在，因此抑制作用总是被再活化而抵消。ZM 336372诱导的c-Raf活化不被MAPK级联激活，蛋白激酶C或磷脂酰肌醇3-激酶的抑制所阻断。ZM 336372 (1 μM)消除过氧化氢处理后eNOS的上调。ZM 336372治疗，在良性肿瘤细胞中导致Raf-1，促分裂原活化蛋白激酶1/2，和细胞外信号调节激酶1/2连续磷酸化，并引起生物活性的激素水平，转录因子，和人无刚毛鳞甲同系物-1显著减少。此外，ZM 336372治疗显著抑制细胞增殖，并诱导细胞周期抑制剂p21和p18。ZM 336372抑制嗜铬细胞瘤细胞的增殖，并抑制NE血管活性肽产生。ZM 336372治疗，在HepG2中诱导剂量依赖性增殖抑制，激素分泌抑制，并上调细胞周期抑制剂。在胰腺癌细胞系中，ZM 336372也会通过Ser 9上GSK-3β的磷酸化作用抑制糖原合成酶激酶-3β，从而诱导细胞凋亡。

GW5074

MB3922

CEP-32496

MB4070

SB590885

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.5677 mL

12.8386 mL

25.6772 mL

5 mM

0.5135 mL

2.5677 mL

5.1354 mL

10 mM

0.2568 mL

1.2839 mL

2.5677 mL

50 mM

0.0514 mL

0.2568 mL

0.5135 mL

体外激酶试验:
C-Raf激酶活性直接在Sl9细胞裂解物中测定。ZM 336372不存在下，人c-Raf在Sf9细胞中通过从杆状病毒载体共表达而激活，载体中包含DNA编码的v-Ras与Lck。随后，在逐渐增加浓度的ZM 336372存在下，分析裂解物中c-Raf活性。

细胞实验

• Cell lines: H727 和 BON
• Concentrations: 在DMSO中溶解，终浓度为~500 μM
• Incubation Time: 48，和 72小时
• Method: 细胞在不同浓度的ZM 336372存在下暴露48和72小时。培育后，移除培养基，并将细胞胰蛋白酶化。细胞在冰上培养，进行流式细胞术前5分钟，加入2.5 μg/mL碘化丙啶。数据使用FACSCalibur benchtop流式细胞仪通过CellQuest获得和分析软件得到。细胞毒性使用Cell Titer Glo试验测定。细胞增殖使用MTT法测量。