Purmorphamine直接结合并激活Smoothened，阻断BODIPY-cyclopamine与Smo结合，在HEK293T细胞中IC50约为1.5 μM，也诱导成骨细胞分化，EC50为1μM

靶点

体外研究

Purmorphamine与Cyclopamine（一种Smo拮抗剂）竞争，直接结合和激活Smoothened，而激活Hedgehog通路，IC50为1.5 μM。 Purmorphamine作用于全能C3H10T1/2 细胞，是有效的骨生成诱导剂。Purmorphamine作用于C3H10T1/2细胞的EC50(根据ALP表达) 为1 μM。Purmorphamine (1 μM) 和BMP-4 (100 ng/mL)联用，作用于3T3-L1细胞，使ALP活性增强90多倍。与BMP-4相比, Purmorphamine作用于多能间充质祖细胞，诱导骨生成，通过激活Hedgehog信号。

体内研究

Purmorphamine作用于基于大鼠结构的人间充质干细胞，上调ALP表达。

SANT-1

MB4142

BMS-833923

MB3901

LDE225 (NVP-LDE225,Erismodegib)

MB4144

Smoothened Agonist (SAG)

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

1.9208 mL

9.6039 mL

19.2079 mL

5 mM

0.3842 mL

1.9208 mL

3.8416 mL

10 mM

–

–

–

50 mM

–

–

–

结合实验:
使用BODIPY-Cyclopamine和过表达Smo的细胞进行Smo结合实验，使用CMV启动子, 含SV40起点的表达载体，获得Smo-Myc3，缺失突变体Smo CRD (68到182位氨基酸缺失), 和Smo CT (556到793位氨基酸缺失)。HEK 293T细胞在12孔板中的聚-D-赖氨酸处理的玻璃盖玻片上生长，直到70％汇合，然后使用FuGene 6，通过适当的表达载体(每孔0.5g)进行转染。转染两天后，HEK 293T细胞与含0.5％小牛血清，5 nM BODIPY-Cyclopamine，和不同浓度的Purmorphamine (0, 1.5, 或5 M) (每孔1 mL)的 DMEM培养基在37°C下温育1小时。然后使用1×PBS缓冲液（每孔1 mL）洗涤过表达Smo的细胞，置于含DAPI的培养基，使用Leica DM4500B荧光显微镜观察。使用固定细胞进行结合检测，使用溶于1×PBS缓冲液（每孔1 mL）的3％多聚甲醛在室温下固定过表达Smo的HEK293T细胞10分钟，然后使用含10mM甘氨酸和0.2％叠氮化钠的1×PBS缓冲液（每孔1 mL）处理5分钟，使用1×PBS缓冲液（每孔1 mL）洗涤，然后再使用含Purmorphamine的培养基在室温下处理4小时。

细胞实验：

• Cell lines: C3H10T1/2 细胞
• Concentrations: 0.5-10 μM
• Incubation Time: 4 天
• Method: C3H10T1/2细胞在T175烧瓶中扩增，第13通道的细胞通过胰蛋白酶/EDTA分离，然后在生长培养基中稀释。使用Multi-dropTM液体传输系统，将产生的细胞悬浮液按每孔2500个细胞接种到黑色透明底384孔板中，孔中为100 µL生长培养基。温育过夜后，细胞附着到孔的底部。使用Mini TrakTM多位分配系统，将溶于DMSO (500 nL)的每组Purmorphamine储存液输送到对应孔中，确保Purmorphamine终浓度为5μM。然后细胞置于37°C下含5% CO2的空气中温育。4天后，除去培养基，10 μL被动裂解缓冲液加入到每孔中。5分钟后，10 μL碱性磷酸酶底物溶液添加到每孔中。在室温下温育15分钟后，在Acquest高通量酶标仪上对实验板进行读数。