MK-2206 2HCl是一种高度选择性的Akt1/2/3抑制剂，在无细胞试验中IC50分别为8 nM/12 nM/65 nM；对250种其他蛋白激酶没有抑制活性。

特性

MK-2206是第一个进入临床研究阶段的Akt小分子变构抑制剂。

靶点

体外研究

MK-2206是变构抑制剂，由pleckstrin同源结构域激活。MK-2206抑制Akt的苏氨酸308位点和丝氨酸473位点的自身磷酸化作用。另外，MK-2206阻止Akt调节的下游信号分子（包括TSC2, PRAS40，及核糖体S6蛋白）的磷酸化作用。与抑制Ras 突变型细胞系(如
NCI-H358, NCI-H23, NCI-H1299, 和Calu-6)相比，MK-2206 更有效地抑制Ras野生型细胞
系(如A431, HCC827, 和NCI-H292)。MK-2206和细胞毒素药剂如erlotinib 和lapatinib联用作用于肺部NCI-H460肿瘤细胞或者卵巢A2780肿瘤细胞，MK-2206也显示出协同效应。

体内研究

MK-2206和这些细胞毒素药剂联用作用于NCI-H292移植瘤，MK-2206显示出非常有效的抗癌活性。卵巢癌A2780移植瘤中，按动物体重，每千克处理240mg MK-2206,则可抑制70%以上的Akt1/2在苏氨酸308位点和丝氨酸473位点的磷酸化，导致肿瘤生长抑制率达到60%。

Akt Inhibitor VIII, Isozyme-Selective,

MB4498

AT13148

MB3647

AZD5363

MB5663

Ipatasertib(GDC0068)

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.0816 mL

10.4082 mL

20.8164 mL

5 mM

0.4163 mL

2.0816 mL

4.1633 mL

10 mM

0.2082 mL

1.0408 mL

2.0816 mL

50 mM

–

–

–

Akt激酶实验:
通过得到的GSK 生物素肽段基质测定Akt激酶。使用含镧系金属螯合物偶联单抗的均相时间分辨荧光(HTRF)测定肽段磷酸化程度，这种单抗专门作用于与链霉亲和素——藻蓝素(SA-APC)载体相结合的磷酸化作用，SA-APC载体可以结合到肽段的部分生物素上。当镧系金属螯合物与藻蓝素相接触时，无辐射的能量从镧系金属螯合物传递给藻蓝素，然后藻蓝素发射波值为655纳米的光线。工作液:100X 蛋白酶抑制剂混合物(PIC)：1mg/ml苯甲脒，0.5 mg/ml 抑肽素, 0.5 mg/ml亮抑肽酶, 0.5 mg/ml 抑肽酶。10X实验 buffer: 500 mM HEPES（pH 为7.5）, 1% PEG, 16.6 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% BSA, 20 mM 9-甘油磷酸。抑制 buffer：50 mM HEPES（pH为7.3）, 16.6 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.1% Triton X-100, 0.17 nM 标记的单抗, 0.0067mg/ml SA-APC。ATP/MgCl2工作液: 1X 实验buffer, 1 mM DTT, 1X PIC, 5% 甘油, 激活的Akt。肽段工作液：1X实验buffer, 1 mM DTT, 1X PIC, 5% 甘油 2 TM GSK生物素肽段。工作液加到合适的孔中，然后加入总负荷为16的 ATP/MgCl2，反应开始。含MK-2206的实验组和对照组加入总负荷为10的肽段工作液。然后加入总负荷为13的酶液，混匀。反应进行50分钟，然后加入总负荷为60的均相时间分辨荧光抑制buffer停止反应。阻断的反应在室温下温育30分钟以上，然后使用仪器读数。

细胞实验：

Cell lines: A431, HCC827, NCI-H292, NCI-H358, NCI-H23, NCI-H1299, Calu-6,和NCI-H460细胞

• Concentrations: 0, 0.3, 1,和3 μM
• Incubation Time: 72或96小时
• Method:

MK-2206溶解在DMSO中，在实验使用前用培养基稀释。细胞按2~3×103密度接种在96孔板上，温育24小时。MK-2206 (分为0, 0.3, 1,和3 μmol四组)处理细胞，72或者96小时后，测定细胞增殖情况。

动物实验：

Animal Models: 携带SK-OV-3, NCI-H292, HCC70, PC-3,和NCI-H460模型的雄性CD1裸鼠

• Formulation: 30% Captisol
• Dosages: 120 mg/kg
• Administration: 口服处理

MK-2461是一种有效的，多靶点抑制剂，作用于c-Met(WT/mutants)，IC50为0.4-2.5 nM，对Ron，和Flt1作用效果稍弱；作用于c-Met比作用于FGFR1， FGFR2， FGFR3， PDGFRβ， KDR， Flt3， Flt4， TrkA和TrkB选择性高8到30倍。

特性

区别于其他已知的ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂，MK-2461优先结合激活的c – Met。而其它抑制物多不具有结合偏好或优先于结合未激活激酶。

靶点

体外研究

MK-2461能有效抑制FGFR1, FGFR2, FGFR3, KDR, TrkA, TrkB和Flt4，IC50分别为65 nM, 39 nM, 50 nM, 44 nM, 46 nM, 61 nM,和 78 nM。相比于野生型c-Met,，MK-2461更有效地抑制致原癌基因c-Met突变体 N1100Y, Y1230C, Y1230H, Y1235D,和M1250Tn1100y， IC 50分别为1.5 nM, 1.5 nM, 1.0 nM, 0.5 nM, 和0.4 nM。MK-2461与磷酸化c – met结合更强。MK-2461有效抑制ATP诱导的c-Met自身磷酸化产生在羧基端对接域，而不是激活环。与此相反，MK-2461在Kato III细胞和h1703细胞中抑制FGFR2 (Y653/Y654)和 PDGFR-α (Y849)的激活环磷酸活化，IC 50均 < 0.3μM。MK-2461在4MBr-5细胞中抑制肝细胞生长因子诱导的丝裂原，IC 50为204nM，和在HPAF II 细胞中肝细胞生长因子诱导的迁移，IC 50为404 nM，以及肝细胞生长因子诱导的MDCK细胞分支管型的形成。此外，MK-2461有效抑制由还Tpr-Met或Tpr-Met（y362c）突变的32D细胞中IL-3非依赖性增殖，IC 50 为~ 100nM。MK-2461明显抑制广谱肿瘤细胞系增殖，特别是针对高表达MET和FGFR2的癌细胞。

体内研究

MK-2461治疗显着抑制在GTL-16 肿瘤中c-Met（y1349）磷酸化，IC 50 ~ 1μM。口服MK-2461剂量为10mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg，每日两次，或200mg/kg，每日一次。口服处理可有效抑制GTL-16移植小鼠模型中肿瘤生长，抑制率分别为62%，77%，75%，和90%。同样，MK-2461处理含c-Met单核苷酸突变T3936C和T3997C的NI H3T 3肿瘤细胞，剂量为134 mg/kg，每天两次，抑制率分别为78%和62%。

Golvatinib (E7050)

MB5669

INCB28060

MB5240

JNJ38877605

MB3950

MK-2461

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.0180 mL

10.0898 mL

20.1796 mL

5 mM

0.4036 mL

2.0180 mL

4.0359 mL

10 mM

0.2018 mL

1.0090 mL

2.0180 mL

50 mM

0.0404 mL

0.2018 mL

0.4036 mL

时间分辨荧光共振能量转移法 :
使用时间分辨荧光共振能量转移法检测N生物素标记多肽(EQEDEPEGDYFEWLE-CONH2)催化c-Met 磷酸化。检测MK-2461 对Ron, Mer, Flt1, Flt3, Flt4, KDR, PDGFRβ, FGFR1, FGFR2, FGFR3, TrkA, 和TrkB的IC 50值。

细胞实验

• Cell lines: SW480, HT29, SW620, Colo 205, HCT116, HCT15, Colo 201, SCC-9, H1993, H1048, GTL-16, SNU15, 等等。
• Concentrations: 溶解于DMSO,终浓度为 ~100 μM
• Incubation Time: 72小时
• Method: 细胞用不同浓度的MK-2461处理 72小时。使用ViaLight PLUS 试剂盒检测肿瘤细胞活性。

动物实验

• Animal Models: GTL-16细胞或c – Met突变转化 NI H3T 3细胞移植于雌性CD-1 nu/nu 小鼠。
• Formulation: 溶解于DMSO,盐溶液稀释
• Dosages: ~134 mg/kg
• Administration: 口服一日两次