Raltegravir (MK-0518)是一种有效的integrase (IN)抑制剂，作用于WT和S217Q PFV IN，在无细胞试验中IC50分别为90 nM和40 nM。它对HIV-1 IN的选择性比对其他相关Mg2+依赖性酶要高1000倍以上，如HCV聚合酶、HIV反转录酶、HIV RNaseH、人类α-, β-, γ-聚合酶。

特性

Raltegravir 是第一个被批准的人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）整合酶抑制剂。

靶点

体外研究

PFV整合携带S217H替换的IN，之后对 Raltegravir 的敏感性降低10倍，IC50为900 nM。PFV IN 具有10% WT 活性，且被Raltegravir抑制，IC50为200 nM,说明与 WT IN相比，对整合酶（IN）链转移抑制剂(INSTI)的敏感性降低约2倍。S217Q PFV IN 对 Raltegravir的敏感性至少与WT 酶相似。Raltegravir由葡萄糖醛酸化，而不是肝脏代谢而来。Raltegravir 在体外作用于人类T 淋巴细胞培养物，有效作用于HIV-1，抑制达95%时浓度为31±20 nM。Raltegravir作用于 CEMx174细胞，也有效作用于HIV-2,IC95为6 nM。Raltegravir 代谢主要通过葡萄糖醛酸化。葡萄糖醛酸化酶的强诱导剂UGT1A1显著降低 Raltegravir 浓度。Raltegravir 微弱抑制肝细胞色素 P450。Raltegravir不会诱导 CYP3A4 RNA 表达或 CYP3A4依赖的睾丸激素 6-β-羟化酶活性。在镁和钙存在时，Raltegravir细胞扩散性降低。Raltegravir 和相关的HIV-1整合酶 (IN) 链转移抑制剂 (INSTIs) 高效阻断病毒复制。 Raltegravir 作用于急性感染人类淋巴 CD4+ T细胞系MT-4和 CEMx174, 高效抑制SIVmac251复制，EC90处于低纳摩尔范围。

体内研究

Raltegravir 作用于携带 SIVmac251感染的非人类灵长类动物，提高病毒-免疫。Raltegravir单独给药非人类灵长类动物后，检测不到病毒载量。

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.2501 mL

11.2506 mL

22.5012 mL

5 mM

0.4500 mL

2.2501 mL

4.5002 mL

10 mM

0.2250 mL

1.1251 mL

2.2501 mL

50 mM

0.0450 mL

0.2250 mL

0.4500 mL

PFV 整合实验:
为了定量分析链转移，供体DNA底物通过退火 HPLC 级寡核苷酸 5′-GACTCACTATAGGGCACGCGTCAAAATTCCATGACA 和 5′-ATTGTCATG GAATTTTGACGCGTGCCCTATAGTGAGTC而形成。反应(40 μL) 含0.75 μM PFV IN, 0.75 μM 供体 DNA, 4 nM (300 ng) 超螺旋 pGEM9-Zf(−) 靶 DNA, 125 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 0.8% (vol/vol) DMSO, 和 25 mM BisTris 丙烷–HCl, pH 7.45。加入指定浓度Raltegravir。加入2 μL PFV IN （在150 mM NaCl, 2 mM DTT, 和 10 mM Tris-HCl, pH 7.4中稀释）开始反应,在 37oC下反应1小时后，加入25 mM EDTA 和 0.5% (wt/vol) SDS终止反应。反应产物通过与 20 μg 蛋白酶 K 在 37oC下消化30分钟而脱蛋白，随后使用乙醇 沉淀,在 在1.5％琼脂糖凝胶上分离，然后通过用溴化乙锭染色观察。通过实时定量PCR, 使用 Platinum SYBR Green qPCR SuperMix 和三种引物 : 5′-CTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAAC, 5′-TTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAAC, 和 5′-GACTCACTATAGGGCACGCGT定量分析整合产物。PCR 反应 (20 μL) 含0.5 μM 每种引物和1 μL 稀释的整合反应产物。在95oC下进行5分钟变性，在CFX96 PCR仪上进行35次循环，再在95oC下变性10秒，在56oC下退火30秒，在68oC下延伸1分钟。在INSTI存在时，使用连续稀释的WT PFV IN 反应，获得标准曲线。

细胞实验

Cell lines: 人类MT-4 细胞

• Concentrations: 0.0001 μM -1 μM
• Incubation Time: 2小时
• Method:

使用 SIVmac251, HIV-1 (IIIB) 和 HIV-2 (CDC 77618)对人类MT-4细胞进行多重感染2小时。然后在PBS中冲洗细胞3次，在有或无一系列一式三份Raltegravir 浓度 (0.0001 μM -1 μM)时，按5 × 105/mL 悬浮在含新鲜培养基 (在原代细胞中加入 50 单位/mL IL-2 ) 的96孔板中。也制备未治疗的感染对照和模拟感染对照，用于比较不同处理法得到的实验数据。通过MTT法(MT-4/MTT实验 )定量分析致MT-4细胞死亡的病毒。显微镜检测发现病毒感染的细胞培养物由于缺乏成簇的能力而大量死亡。移液打断成簇，在 37oC下温育2小时后, 通过光学显微镜l (100 × 放大倍数)观察新簇形成。通过ELISA收集细胞培养上清液，用于测量HIV-1 p24 和 HIV-2/SIVmac251 p27核心抗原。在CEMx174感染的细胞培养物中，具有病毒包膜糖蛋白诱导形成多核体的倾向,按盲实验形式计数多核体，感染5天后，通过光学显微镜观察每孔。

动物实验

Animal Models: 印度猕猴

• Formulation: —
• Dosages: 50 mg/kg 或 100 mg/kg, 每天两次
• Administration: 口服处理

Raltitrexed是一种胸苷酸合成酶抑制剂，抑制L1210细胞生长，IC50为9 nM。

体外研究

Raltitrexed浓度依赖性地诱导双链DNA断裂。在含有野生型p53的Lovo细胞和LS174T细胞系中，Raltitrexed会增加Bax蛋白多达5倍的水平。在HCT-8细胞系中，Raltitrexed导致胞内磷酸核糖焦磷酸（PRPD）增加，这表明了Raltitrexed联合5-FU的细胞毒效应是由于增加的5-FU的核苷酸形成的。在人结肠癌细胞中，Raltitrexed和SN-38联用导致在一定浓度范围内的协同细胞毒性作用。在人结肠癌细胞中，Raltitrexed积极吸收到细胞中，并随后快速的，广泛代谢为一系列polyglutamates，这将导致有效的胸苷酸合成酶的抑制作用。Raltitrexed被非常快地输送到大脑中，并可以在5分钟内在所有的脑组织中被检测到。Raltitrexed和亚叶酸（5FU-FA）联用表现出组合方式依赖的协同抑制增殖作用，通过测算组合系列而定。Raltitrexed结合Vorinostat产生了明显的细胞周期扰动和S-期停滞的协同效应。Raltitrexed是胸苷酸合成酶的一个特定的基于叶酸的抑制剂。对晚期直肠癌的作用活性与氟尿嘧啶（5-氟尿嘧啶）加甲酰四氢叶酸相似。Raltitrexed通过迅速进入细胞，并谷氨酸化产生活性，谷氨酸化衍生物比母体化合物活性高100倍以上。

体内研究

Raltitrexed可以通过在大鼠体内的嗅觉路径被直接输送到大脑。

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.1811 mL

10.9054 mL

21.8107 mL

5 mM

0.4362 mL

2.1811 mL

4.3621 mL

10 mM

0.2181 mL

1.0905 mL

2.1811 mL

50 mM

0.0436 mL

0.2181 mL

0.4362 mL

• 为了评估Raltitrexed对细胞活力和/或生长的影响，GM00637细胞被镀入25 cm2的烧瓶中，密度为每个烧瓶3.3 105个细胞。24小时后，培养基被培养基取代，培养基中添加了不同剂量的Raltitrexed，浓度范围广泛，从小于1 nM到大于1 M.每次测试使用3瓶细胞。细胞暴露于Raltitrexed 24小时，此时细胞被不含Raltitrexed的培养基改装。用无药培养基喂养48小时后，采集细胞并计数。将暴露于不同Raltitrexed剂量的细胞的细胞计数与未暴露于Raltitrexed的对照细胞的细胞计数进行比较，以衡量Raltitrexed对细胞活力和/或生长速度的影响。

动物实验

• Raltitrexed溶解在0.9% NaCl中。实验采用成年(7-8周，19-20 g) C57BL/6小鼠。老鼠保持在22度以下，每12小时进行光照/日晒循环，并用标准鼠粮和自来水喂养。雌鼠与雄鼠交配过夜，第二天早上检查阴道塞。孕鼠阴道塞的存在被认为是孕周0.5。将孕鼠随机分为6组，每组10只。Raltitrexed溶于0.9% NaCl, 5组在孕7.5天腹腔注射不同剂量的Raltitrexed(5、10、11.5、13.5、15 mg/kg b/w)。对照组在妊娠第7.5天腹腔注射0.9% NaCl，注射量相同。孕11.5日处死孕鼠，解剖显微镜下观察胚胎。

TESTS

SPECIFICATIONS

Appearance

Pale yellow or almost white powder

Identification

HNMR

Purity(HPLC)

≥99%