R406 (free base) 是有效的Syk抑制剂，IC50为 41 nM,强抑制Syk而不是Lyn,对Flt3作用效果低5倍。

靶点

脾脏酪氨酸激酶(Syk) (Cell-free assay)

IC50

41 nM

体外研究

R406是ATP竞争性Syk抑制剂，Ki为30 nM。在不同细胞中R406选择性抑制 Syk依赖的信号通路，EC50为33 nM 到171 nM,比作用于 Syk非依赖性通路效果高很多。R406作用于多种弥漫性巨大细胞淋巴瘤，抑制细胞增殖，EC50 为0.8 μM 到8.1 μM。1 μM 或 4 μM R406处理DLBCL细胞系，诱导caspases 9 和3激活, 而不激活caspase 8，导致大部分细胞凋亡。用R406预处理B细胞受体(BCR)交联的对R406 敏感的DLBCLs，完全抑制 SYK525/526磷酸化和BLNK依赖SYK的磷酸化。R406有效降低MMP-9 mRNA水平，处理24和48小时，比对照组分别降低2.8和4.3倍,并降低RL细胞侵袭能力。

体内研究

R406有效作用于多种免疫系统紊乱的动物模型。R406口服给药患免疫复合物导致炎症反应的小鼠，显著抑制皮肤反向被动Arthus反应，按1 mg/kg和 5 mg/kg剂量处理, 与对照组相比则抑制分别为72% 和86%。R406按 10 mg/kg 剂量处理用胶原抗体处理的鼠，显著降低炎症和肿胀, 使渐进性关节炎降低到较低水平，且延迟发病，且作用于K/BxN血清转移小鼠模型，降低临床关节炎达 50% 。

R406

MB3963

R788 (Fostamatinib) Disodium

MB3964

Fostamatinib (R788)

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.1256 mL

10.6281 mL

21.2562 mL

5 mM

0.4251 mL

2.1256 mL

4.2512 mL

10 mM

0.2126 mL

1.0628 mL

2.1256 mL

50 mM

–

–

–

体外荧光偏振激酶实验:
R406在DMSO中连续稀释，然后在激酶buffer(20 mM HEPES, pH 7.4, 5 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 1 mM DTT, 0.1 mg/mL 乙酰化BGG)中稀释到DMSO浓度为1%。室温下加入溶于激酶buffer的ATP和底物, 终DMSO浓度为0.2%。在含 5 μM HS1肽底物 和4 μM ATP的混合物中进行激酶反应，终体积为20 μL，在激酶buffer中加入0.125 ng Syk 开始反应。反应在室温下进行40分钟。加入20 μL 含EDTA/磷酸抗体(1X)/荧光蛋白磷酸肽示踪(0.5X)（在FP稀释buffer中稀释）的PTK猝灭混合物终止反应。然后实验板在室温下黑暗温育30分钟，然后在Polarion荧光偏振读数板上进行读数。R406按11种浓度进行平行实验，使用Prism GraphPad 软件通过回归曲线分析进行曲线拟合而测定IC50值。

细胞实验

• Cell lines: DHL4, DHL6, DHL8, DHL10, Wsu-NHL, Karpas422 (K422), OCI LY1, LY3, LY4, LY7, LY10, LY18, LY19, Pfeiffer, 和 Toledo
• Concentrations: 溶于DMSO，浓度为10 mM,终浓度为5 μM
• Incubation Time: 72或96小时
• Method:

用连续稀释的R406 (0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 或5 μM) 处理DLBCL 细胞系72 或 96小时。通过MTT实验测定细胞增殖，使用annexin V–FITC/碘化丙啶(PI)染色测定细胞凋亡。为了测定caspase9，8和3，细胞裂解，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行大小分离，然后进行免疫印迹。

动物实验

• Animal Models: 静脉注射 1% 卵清蛋白(OVA)的雌性C57BL/6 小鼠，卵清蛋白 (OVA)溶于含1% Evans 蓝染料的盐水(10 mg/kg)中;携带抗胶原抗体诱导型关节炎的雌性Balb/c小鼠；腹腔注射成年K/BxN鼠血清而诱发关节炎的雌性 C57BL/6小鼠
• Formulation: 溶于DMSO，然后在含 35% TPGS, 60% PEG 400, 和5% 丙二醇的盐水中稀释
• Dosages: ~10 mg/kg/day
• Administration: 口服处理

R428是Axl抑制剂，IC50为14 nM, 作用于Axl比作用于Abl选择性高100倍以上。作用于Axl选择性也比作用于Mer和Tyro3(高50到100倍)及InsR, EGFR, HER2, 和PDGFRβ(高100倍以上)高。

靶点

Axl

IC50

14 nM

体外研究

R428阻断Axl的催化和前癌活性。纳摩尔级R428抑制Axl活性并阻断Axl依赖的过程，包括Akt 磷酸化, 乳腺癌细胞入侵以及促炎细胞因子产生。最近一项研究表明Axl 抑制剂R428 对原发性CLL B细胞处理24小时后平均IC50约为2.0μM，而类似条件下正常的B细胞, T细胞和自然杀伤细胞(NK) 在R428 (2.5 μM)浓度时没有明显的细胞死亡

体内研究

药理学研究表明口服R428治疗后可以降低肿瘤中巨噬细胞集落刺激因子和上皮间质转化的转录调节因子Snail的表达，这种作用具有剂量依赖特性。R428在角膜微囊和肿瘤模型中抑制血管新生，这支持了之前的一项研究。在MDA-MB-231心内和4T1原位乳腺癌转移小鼠模型中，R428 治疗可以减轻癌细胞转移负担并延长生存期 (与对照组52天相比中位生存期大于80天，P＜0.05)

TP-0903

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

1.9738 mL

9.8689 mL

19.7379 mL

5 mM

0.3948 mL

1.9738 mL

3.9476 mL

10 mM

0.1974 mL

0.9869 mL

1.9738 mL

50 mM

–

–

–

体外激酶分析:
在体外激酶放射性测量分析中进行R428的五点剂量滴定。同时利用荧光偏振法进行Axl, Mer和 Tyro3的分析。利用Z

细胞实验：

Cell lines: MDA-MB-231或者4T1细胞

• Concentrations: 0.03, 0.3, 3 μM
• Incubation Time: 3 小时
• Method:

在37 ℃条件下让MDA-MB-231或4T1细胞从基质胶沿着24孔Transwell培养板的8微米气孔迁移到20% FCS ，迁移时间16 到 24小时。将未迁移走的细胞和基质胶擦除掉。侵入的细胞用 4% 甲醛固定, 1% 结晶紫染色然后定量用于基于细胞的Axl分析。细胞先与R428预孵育3小时。 Transwell培养室上部和下部都加入 R428 。

动物实验：

Animal Models: 心脏内含有MDA-MB-231-luc-D3H2LN细胞的动物模型

• Formulation: 0.5% 羟丙基甲基纤维素 + 0.1% 吐温80
• Dosages: 125 mg/kg
• Administration: 口服，一天两次