R406是有效的Syk抑制剂，IC50为41 nM, 强抑制Syk，但是不抑制Lyn,作用于Flt3效果低5倍。

靶点

Flt3(Cell-free assay)

 Syk(Cell-free assay)
41 nM

体外研究

R406强抑制免疫球蛋白 E (IgE)和 IgG调节的受体信号活性。R406抑制IgE抗体诱导的 LTC4 ，细胞因子和趋化因子的产生和释放, 包括TNFα, IL-8, 和GM-CSF。R406抑制肥大细胞中T细胞Syk底物链接蛋白的激活和B细胞中B细胞链接蛋白/SLP65的磷酸化作用。R406 结合到Syk的ATP结合袋中，抑制Syk的激酶活性， R406是ATP竞争性抑制剂，Ki为30 nM。R406阻断单核细胞/巨噬细胞和中性白细胞中Syk依赖的FcR调节活性，且阻断B淋巴细胞中BCR调节活性。R406 明显诱导慢性淋巴细胞白血病（CCL）细胞凋亡，且阻断CCL3和CCL4 分泌。R406有效抑制血小板信号，且抑制使用特殊抗体或 HIT 病患的血浆通过FcγRIIA 交叉结合形成的功能。

体内研究

在已经预防处理的鼠内进行阳性Arthus 反应，5 mg/kg R406诱导鼠皮肤病变达到86%。R406作用于抗体诱导的关节炎鼠模型，也有效抑制炎症。自身免疫反应时，R406不会影响巨噬细胞和嗜中性粒细胞的功能，免疫毒性为最低水平。

特征

R406是治疗风湿性关节炎的潜在领先药物。

R406 (free base)

MB3963

R788 (Fostamatinib) Disodium

MB5554

Alogliptin(SYK-322) benzoate

MB3964

Fostamatinib (R788)

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

1.5908 mL

7.9538 mL

15.9076 mL

5 mM

0.3182 mL

1.5908 mL

3.1815 mL

10 mM

0.1591 mL

0.7954 mL

1.5908 mL

50 mM

0.0318 mL

0.1591 mL

0.3182 mL

• Animal Models: 在C57BL/6鼠中腹腔注射150 μL 取自成年K/BxN鼠的混合血清诱导产生关节炎。
• Formulation: 35% TPGS, 60% PEG 400, 和5% 丙二醇
• Dosages: 1 或5 mg/kg
• Administration: 口服处理

R406 (free base) 是有效的Syk抑制剂，IC50为 41 nM,强抑制Syk而不是Lyn,对Flt3作用效果低5倍。

靶点

脾脏酪氨酸激酶(Syk) (Cell-free assay)

IC50

41 nM

体外研究

R406是ATP竞争性Syk抑制剂，Ki为30 nM。在不同细胞中R406选择性抑制 Syk依赖的信号通路，EC50为33 nM 到171 nM,比作用于 Syk非依赖性通路效果高很多。R406作用于多种弥漫性巨大细胞淋巴瘤，抑制细胞增殖，EC50 为0.8 μM 到8.1 μM。1 μM 或 4 μM R406处理DLBCL细胞系，诱导caspases 9 和3激活, 而不激活caspase 8，导致大部分细胞凋亡。用R406预处理B细胞受体(BCR)交联的对R406 敏感的DLBCLs，完全抑制 SYK525/526磷酸化和BLNK依赖SYK的磷酸化。R406有效降低MMP-9 mRNA水平，处理24和48小时，比对照组分别降低2.8和4.3倍,并降低RL细胞侵袭能力。

体内研究

R406有效作用于多种免疫系统紊乱的动物模型。R406口服给药患免疫复合物导致炎症反应的小鼠，显著抑制皮肤反向被动Arthus反应，按1 mg/kg和 5 mg/kg剂量处理, 与对照组相比则抑制分别为72% 和86%。R406按 10 mg/kg 剂量处理用胶原抗体处理的鼠，显著降低炎症和肿胀, 使渐进性关节炎降低到较低水平，且延迟发病，且作用于K/BxN血清转移小鼠模型，降低临床关节炎达 50% 。

R406

MB3963

R788 (Fostamatinib) Disodium

MB3964

Fostamatinib (R788)

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.1256 mL

10.6281 mL

21.2562 mL

5 mM

0.4251 mL

2.1256 mL

4.2512 mL

10 mM

0.2126 mL

1.0628 mL

2.1256 mL

50 mM

–

–

–

体外荧光偏振激酶实验:
R406在DMSO中连续稀释，然后在激酶buffer(20 mM HEPES, pH 7.4, 5 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 1 mM DTT, 0.1 mg/mL 乙酰化BGG)中稀释到DMSO浓度为1%。室温下加入溶于激酶buffer的ATP和底物, 终DMSO浓度为0.2%。在含 5 μM HS1肽底物 和4 μM ATP的混合物中进行激酶反应，终体积为20 μL，在激酶buffer中加入0.125 ng Syk 开始反应。反应在室温下进行40分钟。加入20 μL 含EDTA/磷酸抗体(1X)/荧光蛋白磷酸肽示踪(0.5X)（在FP稀释buffer中稀释）的PTK猝灭混合物终止反应。然后实验板在室温下黑暗温育30分钟，然后在Polarion荧光偏振读数板上进行读数。R406按11种浓度进行平行实验，使用Prism GraphPad 软件通过回归曲线分析进行曲线拟合而测定IC50值。

细胞实验

• Cell lines: DHL4, DHL6, DHL8, DHL10, Wsu-NHL, Karpas422 (K422), OCI LY1, LY3, LY4, LY7, LY10, LY18, LY19, Pfeiffer, 和 Toledo
• Concentrations: 溶于DMSO，浓度为10 mM,终浓度为5 μM
• Incubation Time: 72或96小时
• Method:

用连续稀释的R406 (0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 或5 μM) 处理DLBCL 细胞系72 或 96小时。通过MTT实验测定细胞增殖，使用annexin V–FITC/碘化丙啶(PI)染色测定细胞凋亡。为了测定caspase9，8和3，细胞裂解，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行大小分离，然后进行免疫印迹。

动物实验

• Animal Models: 静脉注射 1% 卵清蛋白(OVA)的雌性C57BL/6 小鼠，卵清蛋白 (OVA)溶于含1% Evans 蓝染料的盐水(10 mg/kg)中;携带抗胶原抗体诱导型关节炎的雌性Balb/c小鼠；腹腔注射成年K/BxN鼠血清而诱发关节炎的雌性 C57BL/6小鼠
• Formulation: 溶于DMSO，然后在含 35% TPGS, 60% PEG 400, 和5% 丙二醇的盐水中稀释
• Dosages: ~10 mg/kg/day
• Administration: 口服处理

R428是Axl抑制剂，IC50为14 nM, 作用于Axl比作用于Abl选择性高100倍以上。作用于Axl选择性也比作用于Mer和Tyro3(高50到100倍)及InsR, EGFR, HER2, 和PDGFRβ(高100倍以上)高。

靶点

Axl

IC50

14 nM

体外研究

R428阻断Axl的催化和前癌活性。纳摩尔级R428抑制Axl活性并阻断Axl依赖的过程，包括Akt 磷酸化, 乳腺癌细胞入侵以及促炎细胞因子产生。最近一项研究表明Axl 抑制剂R428 对原发性CLL B细胞处理24小时后平均IC50约为2.0μM，而类似条件下正常的B细胞, T细胞和自然杀伤细胞(NK) 在R428 (2.5 μM)浓度时没有明显的细胞死亡

体内研究

药理学研究表明口服R428治疗后可以降低肿瘤中巨噬细胞集落刺激因子和上皮间质转化的转录调节因子Snail的表达，这种作用具有剂量依赖特性。R428在角膜微囊和肿瘤模型中抑制血管新生，这支持了之前的一项研究。在MDA-MB-231心内和4T1原位乳腺癌转移小鼠模型中，R428 治疗可以减轻癌细胞转移负担并延长生存期 (与对照组52天相比中位生存期大于80天，P＜0.05)

TP-0903

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

1.9738 mL

9.8689 mL

19.7379 mL

5 mM

0.3948 mL

1.9738 mL

3.9476 mL

10 mM

0.1974 mL

0.9869 mL

1.9738 mL

50 mM

–

–

–

体外激酶分析:
在体外激酶放射性测量分析中进行R428的五点剂量滴定。同时利用荧光偏振法进行Axl, Mer和 Tyro3的分析。利用Z

细胞实验：

Cell lines: MDA-MB-231或者4T1细胞

• Concentrations: 0.03, 0.3, 3 μM
• Incubation Time: 3 小时
• Method:

在37 ℃条件下让MDA-MB-231或4T1细胞从基质胶沿着24孔Transwell培养板的8微米气孔迁移到20% FCS ，迁移时间16 到 24小时。将未迁移走的细胞和基质胶擦除掉。侵入的细胞用 4% 甲醛固定, 1% 结晶紫染色然后定量用于基于细胞的Axl分析。细胞先与R428预孵育3小时。 Transwell培养室上部和下部都加入 R428 。

动物实验：

Animal Models: 心脏内含有MDA-MB-231-luc-D3H2LN细胞的动物模型

• Formulation: 0.5% 羟丙基甲基纤维素 + 0.1% 吐温80
• Dosages: 125 mg/kg
• Administration: 口服，一天两次

R788 (Fostamatinib) disodium是活性代谢产物R406的前体药物, 是Syk抑制剂，IC50为41 nM, 强抑制 Syk但不抑制Lyn,对Flt3作用效果低5倍。

靶点

Syk

IC50

41 nM

体外研究

R935788是R406亚甲基磷酸言药物前体,可在体内快速转化为R406。R406(R935788的活性形式)选择性抑制Syk依赖性信号，EC50为33 nM到171 nM,比作用于Syk非依赖性通路更有效。R406抑制多种弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系增殖，EC50为 0.8 μM到8.1 μM。R406 处理，降低BLNK, Akt, GSK-3, FOXO和ERK 磷酸化。此外, R406作用于TCL1白血病，完全抑制抗-IgM抗体诱导的BCR信号。尽管TCL1白血病中存在高水平的组成型激活的Syk，但是R406对白血病细胞没有选择毒性

体内研究

考虑到R406作用于小鼠的血浆半衰期短于 2小时，R935788分3次给药，每次间隔3小时，确保在每次给药期间Syk得到持续抑制，模仿作用于人类的较长血浆半衰期(15小时)。尽管在体外细胞毒性作用相对温和，但是R935788在体内显著抑制白血病细胞增殖和存活，这与阻止抗原依赖性B细胞受体（BCR）的信号相关，而与抑制组成型Syk活性无关。R935788每天按80 mg/kg剂量处理小鼠，持续 18-21 天，有效抑制 TCL1-002, TCL1-551 和 TCL1-870肿瘤生长，在处理末期观察不到白血病CD5+/B220+细胞，R935788显著延长处理鼠的寿命，平均寿命从 45/46天提高到170/172 天, 且在后期6个月的处理期间完全根除相当大比例的恶性细胞，且不会影响正常 B 淋巴细胞的产生。R935788治疗也诱导正常和恶性B细胞从脾脏和淋巴结中短暂迁移到外周血中，随后选择性抑制恶性B细胞生长。此外, R935788作用于Eμ-TCL1转基因小鼠，也有效作用于自发的TCL1白血病。

特征

R935788是临床上常用的药物前体 R406的口服试剂, 在药物性能上优于R406，具有较高的溶解度和生物利用度。

Fostamatinib (R788)

MB3912

R406

MB3962

R406 (free base)

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

1.6015 mL

8.0074 mL

16.0149 mL

5 mM

0.3203 mL

1.6015 mL

3.2030 mL

10 mM

–

–

–

50 mM

–

–

–

体外荧光偏振激酶检测实验:
R406在 DMSO中连续稀释，然后在激酶buffer(20 mM HEPES, pH 7.4, 5 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 1 mM DTT, 0.1 mg/mL 乙酰 BGG)中稀释到 1% DMSO。室温下，在激酶 buffer中加入ATP和底物，使DMSO 终浓度为0.2%。在含 5 μM HS1 肽底物和 4 μM ATP 的混合物中进行激酶反应，终体积为 20 μL，然后在激酶buffer中加入0.125 ng Syk 开始反应。反应在室温下进行40分钟。加入含EDTA/抗磷酸抗体/荧光磷酸示踪物（在FP 稀释 Buffer中稀释）的20 μL PTK淬灭混合物，反应终止。反应在室温下暗中反应30分钟，然后在Polarion 荧光偏振酶标仪上读数。通过与酪氨酸激酶实验试剂盒中的磷酸竞争剂竞争获得校准曲线，数据转换为磷酸数量。为了测定IC50，测定11种浓度R406，重复进行实验，使用 Prism GraphPad 软件，通过非线性回归分析进行曲线拟合。

细胞实验

• Cell lines: TCL1-002, TCL1-252, TCL1-551, TCL1-870, 和TCL1-540
• Concentrations: 溶于DMSO,终浓度为~10 μM
• Incubation Time: 48小时
• Method:

使用浓度不断增高的R406处理细胞 48小时。使用碘化丙啶(PI)和膜联蛋白-A5–FITC 联合双染色，测定凋亡细胞百分数。使用 FITC小鼠抗–Ki-67 抗体进行 Ki-67染色。通过FACSCalibur流式细胞仪，使用CellQuest Version 3.3 软件分析样本。

动物实验

• Animal Models: 腹腔注射 TCL1-002, TCL1-551, 或 TCL1-870 白血病细胞的雌性B6/C3H F1小鼠 , 和 Eμ-TCL1转基因小鼠
• Formulation: 在 0.1%羧甲基纤维素钠，0.1％甲酯，和0.02％丙酯 (pH 6.5)混合物中配制4 mg/mL溶液
• Dosages: 80 mg/kg/day
• Administration: 分3种剂量每个3小时腹腔注射

530.50

化学式

C27H21F3N8O

CAS号

926037-48-1

稳定性

3 years -20°C powder

2 years -80°C in solvent

100 mg/mL (188.5 mM)

Water

<1 mg/mL 难溶或者不溶

Ethanol

<1 mg/mL 难溶或者不溶

Radotinib是一种选择性 BCR-ABL1 酪氨酸激酶抑制剂，IC50 为 34 nM，用于治疗慢性髓性白血病。

靶点

体外研究

在体外，Radotinib结合到BCR-ABL1，并减少一个BCR-ABL1靶蛋白，CrkL的磷酸化。Radotinib也会有效抑制BCR-ABL1的正常突变克隆珠的增殖，而对T315I没有影响。在AML细胞中，radotinib显著降低细胞活性，促进分化，并诱导CD11b表达和凋亡。在NB4，THP-1，和Kasumi-1细胞中，radotinib也会诱导CD11b表达，并降低活性。

Raltegravir (MK-0518)是一种有效的integrase (IN)抑制剂，作用于WT和S217Q PFV IN，在无细胞试验中IC50分别为90 nM和40 nM。它对HIV-1 IN的选择性比对其他相关Mg2+依赖性酶要高1000倍以上，如HCV聚合酶、HIV反转录酶、HIV RNaseH、人类α-, β-, γ-聚合酶。

特性

Raltegravir 是第一个被批准的人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）整合酶抑制剂。

靶点

体外研究

PFV整合携带S217H替换的IN，之后对 Raltegravir 的敏感性降低10倍，IC50为900 nM。PFV IN 具有10% WT 活性，且被Raltegravir抑制，IC50为200 nM,说明与 WT IN相比，对整合酶（IN）链转移抑制剂(INSTI)的敏感性降低约2倍。S217Q PFV IN 对 Raltegravir的敏感性至少与WT 酶相似。Raltegravir由葡萄糖醛酸化，而不是肝脏代谢而来。Raltegravir 在体外作用于人类T 淋巴细胞培养物，有效作用于HIV-1，抑制达95%时浓度为31±20 nM。Raltegravir作用于 CEMx174细胞，也有效作用于HIV-2,IC95为6 nM。Raltegravir 代谢主要通过葡萄糖醛酸化。葡萄糖醛酸化酶的强诱导剂UGT1A1显著降低 Raltegravir 浓度。Raltegravir 微弱抑制肝细胞色素 P450。Raltegravir不会诱导 CYP3A4 RNA 表达或 CYP3A4依赖的睾丸激素 6-β-羟化酶活性。在镁和钙存在时，Raltegravir细胞扩散性降低。Raltegravir 和相关的HIV-1整合酶 (IN) 链转移抑制剂 (INSTIs) 高效阻断病毒复制。 Raltegravir 作用于急性感染人类淋巴 CD4+ T细胞系MT-4和 CEMx174, 高效抑制SIVmac251复制，EC90处于低纳摩尔范围。

体内研究

Raltegravir 作用于携带 SIVmac251感染的非人类灵长类动物，提高病毒-免疫。Raltegravir单独给药非人类灵长类动物后，检测不到病毒载量。

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.2501 mL

11.2506 mL

22.5012 mL

5 mM

0.4500 mL

2.2501 mL

4.5002 mL

10 mM

0.2250 mL

1.1251 mL

2.2501 mL

50 mM

0.0450 mL

0.2250 mL

0.4500 mL

PFV 整合实验:
为了定量分析链转移，供体DNA底物通过退火 HPLC 级寡核苷酸 5′-GACTCACTATAGGGCACGCGTCAAAATTCCATGACA 和 5′-ATTGTCATG GAATTTTGACGCGTGCCCTATAGTGAGTC而形成。反应(40 μL) 含0.75 μM PFV IN, 0.75 μM 供体 DNA, 4 nM (300 ng) 超螺旋 pGEM9-Zf(−) 靶 DNA, 125 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 0.8% (vol/vol) DMSO, 和 25 mM BisTris 丙烷–HCl, pH 7.45。加入指定浓度Raltegravir。加入2 μL PFV IN （在150 mM NaCl, 2 mM DTT, 和 10 mM Tris-HCl, pH 7.4中稀释）开始反应,在 37oC下反应1小时后，加入25 mM EDTA 和 0.5% (wt/vol) SDS终止反应。反应产物通过与 20 μg 蛋白酶 K 在 37oC下消化30分钟而脱蛋白，随后使用乙醇 沉淀,在 在1.5％琼脂糖凝胶上分离，然后通过用溴化乙锭染色观察。通过实时定量PCR, 使用 Platinum SYBR Green qPCR SuperMix 和三种引物 : 5′-CTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAAC, 5′-TTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAAC, 和 5′-GACTCACTATAGGGCACGCGT定量分析整合产物。PCR 反应 (20 μL) 含0.5 μM 每种引物和1 μL 稀释的整合反应产物。在95oC下进行5分钟变性，在CFX96 PCR仪上进行35次循环，再在95oC下变性10秒，在56oC下退火30秒，在68oC下延伸1分钟。在INSTI存在时，使用连续稀释的WT PFV IN 反应，获得标准曲线。

细胞实验

Cell lines: 人类MT-4 细胞

• Concentrations: 0.0001 μM -1 μM
• Incubation Time: 2小时
• Method:

使用 SIVmac251, HIV-1 (IIIB) 和 HIV-2 (CDC 77618)对人类MT-4细胞进行多重感染2小时。然后在PBS中冲洗细胞3次，在有或无一系列一式三份Raltegravir 浓度 (0.0001 μM -1 μM)时，按5 × 105/mL 悬浮在含新鲜培养基 (在原代细胞中加入 50 单位/mL IL-2 ) 的96孔板中。也制备未治疗的感染对照和模拟感染对照，用于比较不同处理法得到的实验数据。通过MTT法(MT-4/MTT实验 )定量分析致MT-4细胞死亡的病毒。显微镜检测发现病毒感染的细胞培养物由于缺乏成簇的能力而大量死亡。移液打断成簇，在 37oC下温育2小时后, 通过光学显微镜l (100 × 放大倍数)观察新簇形成。通过ELISA收集细胞培养上清液，用于测量HIV-1 p24 和 HIV-2/SIVmac251 p27核心抗原。在CEMx174感染的细胞培养物中，具有病毒包膜糖蛋白诱导形成多核体的倾向,按盲实验形式计数多核体，感染5天后，通过光学显微镜观察每孔。

动物实验

Animal Models: 印度猕猴

• Formulation: —
• Dosages: 50 mg/kg 或 100 mg/kg, 每天两次
• Administration: 口服处理

Raltitrexed是一种胸苷酸合成酶抑制剂，抑制L1210细胞生长，IC50为9 nM。

体外研究

Raltitrexed浓度依赖性地诱导双链DNA断裂。在含有野生型p53的Lovo细胞和LS174T细胞系中，Raltitrexed会增加Bax蛋白多达5倍的水平。在HCT-8细胞系中，Raltitrexed导致胞内磷酸核糖焦磷酸（PRPD）增加，这表明了Raltitrexed联合5-FU的细胞毒效应是由于增加的5-FU的核苷酸形成的。在人结肠癌细胞中，Raltitrexed和SN-38联用导致在一定浓度范围内的协同细胞毒性作用。在人结肠癌细胞中，Raltitrexed积极吸收到细胞中，并随后快速的，广泛代谢为一系列polyglutamates，这将导致有效的胸苷酸合成酶的抑制作用。Raltitrexed被非常快地输送到大脑中，并可以在5分钟内在所有的脑组织中被检测到。Raltitrexed和亚叶酸（5FU-FA）联用表现出组合方式依赖的协同抑制增殖作用，通过测算组合系列而定。Raltitrexed结合Vorinostat产生了明显的细胞周期扰动和S-期停滞的协同效应。Raltitrexed是胸苷酸合成酶的一个特定的基于叶酸的抑制剂。对晚期直肠癌的作用活性与氟尿嘧啶（5-氟尿嘧啶）加甲酰四氢叶酸相似。Raltitrexed通过迅速进入细胞，并谷氨酸化产生活性，谷氨酸化衍生物比母体化合物活性高100倍以上。

体内研究

Raltitrexed可以通过在大鼠体内的嗅觉路径被直接输送到大脑。

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.1811 mL

10.9054 mL

21.8107 mL

5 mM

0.4362 mL

2.1811 mL

4.3621 mL

10 mM

0.2181 mL

1.0905 mL

2.1811 mL

50 mM

0.0436 mL

0.2181 mL

0.4362 mL

• 为了评估Raltitrexed对细胞活力和/或生长的影响，GM00637细胞被镀入25 cm2的烧瓶中，密度为每个烧瓶3.3 105个细胞。24小时后，培养基被培养基取代，培养基中添加了不同剂量的Raltitrexed，浓度范围广泛，从小于1 nM到大于1 M.每次测试使用3瓶细胞。细胞暴露于Raltitrexed 24小时，此时细胞被不含Raltitrexed的培养基改装。用无药培养基喂养48小时后，采集细胞并计数。将暴露于不同Raltitrexed剂量的细胞的细胞计数与未暴露于Raltitrexed的对照细胞的细胞计数进行比较，以衡量Raltitrexed对细胞活力和/或生长速度的影响。

动物实验

• Raltitrexed溶解在0.9% NaCl中。实验采用成年(7-8周，19-20 g) C57BL/6小鼠。老鼠保持在22度以下，每12小时进行光照/日晒循环，并用标准鼠粮和自来水喂养。雌鼠与雄鼠交配过夜，第二天早上检查阴道塞。孕鼠阴道塞的存在被认为是孕周0.5。将孕鼠随机分为6组，每组10只。Raltitrexed溶于0.9% NaCl, 5组在孕7.5天腹腔注射不同剂量的Raltitrexed(5、10、11.5、13.5、15 mg/kg b/w)。对照组在妊娠第7.5天腹腔注射0.9% NaCl，注射量相同。孕11.5日处死孕鼠，解剖显微镜下观察胚胎。

TESTS

SPECIFICATIONS

Appearance

Pale yellow or almost white powder

Identification

HNMR

Purity(HPLC)

≥99%

TESTS

SPECIFICATIONS

Appearance

Off-white to yellow crystalline powder,odorless

Solubility

20mg/ml DMSO ,clear

Loss on drying

≤0.5%

Identification

HNMR

Assay

≥98.0%