ARQ-197是第一个非ATP竞争性的c-Met抑制剂，Ki为0.355 μM,对Ron几乎没有作用活性,对EGFR, InsR, PDGFRα 和 FGFR1/4没有抑制作用。

靶点

c-Met

IC50

0.1 μM

体外研究

ARQ-197抑制HGF/c-met诱导的细胞反应。ARQ-197具有抗肿瘤活性，抑制A549, DBTRG和NCI-H441细胞增殖，IC50分别为0.38, 0.45, 0.29 μM。用ARQ-197处理，导致MAPK信号级联放大磷酸化降低，且阻断入侵和迁移。此外,没有内源性c-Met表达的NCI-H661细胞中c-Met异常表达，形成一种入侵表现型，也被ARQ-197抑制。加入浓度不断增加的ARQ-197不会明显影响ATP的Km值，但是用0.5 μM ARQ-197处理c-Met，则降低c-Met的Vmax值，降低3倍。ARQ-197降低Vmax而不影响ATP的Km值说明ARQ-197抑制c-Met是非ATP竞争抑制，也说明ARQ-197具有高度激酶选择性。ARQ-197抑制人类重组c-Met，具有恒定的Ki值，为355 nM。虽然使用过的ATP最高浓度为200 μM, 但是当ATP浓度为1 mM时，ARQ-197抑制c-Met效果不会降低。ARQ-197抑制c-Met磷酸化，且阻断下游c-Met信号通路。ARQ-197阻断组成型和配体调节的c-Met自磷酸化，通过增强c-Met活性, 反过来抑制下游c-Met效应器。ARQ-197作用于表达c-Met的人类癌细胞包括HT29, MKN-45, 和MDA-MB-231细胞，诱导caspase依赖的凋亡。

体内研究

ARQ-197处理 HT29,MKN-45,和MDA-MB-231三种移植瘤模型，肿瘤生长率分别降低66%,45%,和79%。ARQ-197按200 mg/kg剂量口服给药这三种移植瘤模型，显示体重都没有明显改变。药效学方面，ARQ-197作用于人类结肠移植瘤HT29，强抑制c-Met的磷酸化, ARQ-197按200 mg/kg剂量单独口服给药24小时后，c-Met自磷酸化强烈下降。总之，ARQ-197抑制人类c-Met依赖的移植瘤生长。

特征

ARQ-197是第一个应用到晚期人类临床试验的c-Met选择性抑制剂。

INCB28060

MB5240

JNJ38877605

MB8803

PHA-665752

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.7069 mL

13.5347 mL

27.0695 mL

5 mM

0.5414 mL

2.7069 mL

5.4139 mL

10 mM

0.2707 mL

1.3535 mL

2.7069 mL

50 mM

0.0541 mL

0.2707 mL

0.5414 mL

体外c-Met SDS-PAGE 激酶试验:
100 ng重组c-Met蛋白和浓度不断增高ARQ-197在室温下预温育30分钟。随后，100 μM 聚Glu-Tyr底物和含5 μCi[γ-32P]ATP的不同浓度ATP加到反应混合物中。反应在室温下进行5分钟，然后加入5 μL SDS-聚丙烯酰胺胶,降低样本缓冲液。上样到7.5%丙烯酰胺胶上，进行SDS-PAGE。通过放射自显影观察到磷酸化的聚Glu-Tyr底物。通过光密度法测定c-Met活性。

细胞实验

• Cell lines: T29, MKN-45和MDA-MB-231细胞
• Concentrations: 0.03-10 μM
• Incubation Time: 24, 32,和48细胞
• Method: HT29,MKN-45,和MDA-MB-231细胞按每孔5×103个接种在96孔板上，孔中有含10% FBS的培养基，在黑暗中过夜处理。第二天,用浓度不断增长的ARQ-197 (0.03-10 μM)在37oC下处理细胞24,32,和48 小时。ARQ-197处理后，移除培养基，细胞在含2 μg/mL Hoescht 33342的标签溶液(10 mM HEPES, 140 mM NaCl,和6 mM CaCl2)中温育至少10分钟, 用Annexin V-FITC(稀释500倍)和1 μg/mL碘化丙锭染色。进行高含量的图像采集和分析，每孔获取四个图像。 4,6-二脒基-2-苯基吲哚, FITC, 和罗丹明通道分别在16.7 ms/10%, 500 ms/35% ,和300 ms/30% 进行处理。处理图像，测定每组通道和每种情况下的阳性细胞数。此外,在有或者没有25,50,和100 μM ZvAD-FMK存在条件下，HT29细胞用浓度不断增加的ARQ-197处理32小时。所有实验重复进行三次。测定抑制c-Met是否导致细胞凋亡，当使用siRNA分解磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和c-Met时ARQ-197的作用效果。HT29, MKN-45,和MDA-MB-231细胞转染无靶点对照 siRNA, GAPDH靶点对照siRNA, 或met靶点siRNA。3天后，使用特点抗体测定c-Met, GAPDH, 和 β-actin表达水平。为了测定caspase依赖是否影响，HT29, MKN-45, 和MDA-MB-231细胞转染 met靶点 siRNA，进行2天。然后在有或没有浓度不断增高的ZvAD-FMK存在下再温育1天。无靶点siRNA和GAPDH siRNA也转染，作为对照。然后用Annexin V-FITC和碘化丙锭进行细胞染色,测定凋亡细胞百分数。

动物实验

• Animal Models: 携带HT29,MKN-45,或MDA-MB-231移植瘤的无胸腺裸鼠
• Formulation: 溶于PEG 400/20% 维生素E，聚乙二醇琥珀(60:40) 30 mg/mL
• Dosages: 200 mg/kg
• Administration: 口服处理

TM5275 sodium是纤溶酶原激活物抑制剂 (PAI-1)，IC50值为6.95 μM。

靶点&IC50

IC50: 6.95 μM (PAI-1)

体外研究

对接研究表明，TM5255与PAI-1的Aβ片（S4A）位置的链4结合。TM5255是一种选择性PAI-1和（最多100μμm）不干扰其他SerpN/丝氨酸蛋白酶系统。TM5255浓度为20μm和100μm时，通过抑制TPA-GFP－PAI-1高分子量复合物的形成，显著延长了TPA GFP在VECs上的滞留。TM5255增强了纤溶酶原的时间依赖性积累以及纤维蛋白凝块在TPA GFP表达细胞周围的溶解。在ES-2和JHOC-9细胞中，72小时处理的细胞活力随着70～100μm TM5255的降低而降低。从48小时到96小时，细胞生长受到抑制，100μm TM5255。与对照组相比，100μm TM5255处理的细胞中PAI-1活性明显降低。TM5255在PAI-1高表达的卵巢癌中发挥抗增殖作用。

体内研究

TM5255具有良好的药代动力学特征，对小鼠和大鼠的毒性非常低。大鼠血栓形成模型。10和50 mg/kg TM5255（60.9±3和56.8±2.8 mg）的大鼠血液凝块重量显著低于对照组（72.5±2 mg）。TM5255（50毫克mg/kg）的抗血栓有效性相当于噻氯匹定（500毫克mg/kg）。TM5255浓度为10 mg/mg/kg时，血浆浓度达到17.5±5.2μm。TM5255（5 mg/mg/kg）联合TPA（0.3 mg/mg/kg）显著提高TPA（0.3 mg/mg/kg）的抗血栓作用，并与高TPA剂量（3 mg/mg/kg）相似。

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

1.8349 mL

9.1746 mL

18.3493 mL

5 mM

0.3670 mL

1.8349 mL

3.6699 mL

10 mM

0.1835 mL

0.9175 mL

1.8349 mL

• TM5255具有良好的药代动力学特征，对小鼠和大鼠的毒性非常低。大鼠血栓形成模型。10和50 mg/kg TM5255（60.9±3和56.8±2.8 mg）的大鼠血液凝块重量显著低于对照组（72.5±2 mg）。TM5255（50毫克mg/kg）的抗血栓有效性相当于噻氯匹定（500毫克mg/kg）。TM5255浓度为10 mg/mg/kg时，血浆浓度达到17.5±5.2μm。TM5255（5毫克mg/kg）与TPA（0.3 mg/mg／kg）联合应用可显著提高TPA（0.3 mg/mg/kg）的抗血栓作用，并与高TPA剂量（3毫克mg/kg）相比有显著益处

细胞实验

• TM5275在DMSO中制备。
• ES2细胞用DMSO（对照）或100μMTM5275处理指定的时间（24,48,72,96小时）。 通过CellTiter-Glo测定来确定细胞生长。

动物实验

• TM5255悬浮于0.5%羧甲基纤维素钠盐（CMC）中。
• 大鼠：在雄性CD大鼠中实现动静脉旁路血栓形成。TM5255（10和50毫克mg/kg，n＝9）或噻氯匹定（500毫克mg/kg，n＝6），悬浮于0.5% CMC溶液中，在研究前口服90分钟，口服给药。对照组仅给予0.5% CMC溶液（n＝10）。血液允许通过分流术循环30分钟。最终测量覆盖丝线的血栓的湿重。
• 小鼠：TM5255通过灌胃给雄性ICR小鼠（50毫克mg/kg）口服。在口服给药前（0小时）和1, 2, 6、24 h从静脉收集肝素化血液样品。反相高效液相色谱法测定血浆药物浓度